胶质瘤起源于神经胶质细胞,是原发于中枢神经系统的最常见的恶性肿瘤。胶质瘤具有高侵袭性、高复发率和高致死率的特点。而且胶质瘤与正常脑组织缺乏明显的界限,手术难以完全切除,并且在脑干等重要部位生长的胶质瘤,甚至无法行手术治疗,其对放疗化疗亦不甚敏感,临床治疗效果差。胶质瘤的发生、发展机制至今尚未完全阐明,更好的探讨胶质瘤的发病机理对于制定有效的治疗方案尤为重要。GAB2(Grb2相关结合蛋白2)隶属于一种进化保留蛋白家族,除哺乳动物体内的GAB1、GAB2、和GAB3,这种蛋白家族包括三种哺乳类旁系同源:黑腹果蝇同族体DOS(daughter of sevenless),秀丽隐杆线虫同族体SOC1(suppressor of clear-1)和海葵内 Ne-Gab(Nematostella-Gab)。GAB2 家族成员中表现出 40%到50%序列同源性,但是各自表现出独特的细胞功能。GAB1和GAB2在多种组织器官中广泛表达,在脑、肾、肺、心、睾丸及卵巢中高表达,GAB2定位于染色体链11q14.1,11q13-14的扩增常见于人类恶性肿瘤,近年来,一系列的研究及实验证实GAB2与恶性肿瘤细胞的迁移和侵袭有关,在人类恶性肿瘤的发生和生长过程中发挥着重要作用。一些学者发现GAB2在卵巢肿瘤中出现高表达并且GAB2在卵巢癌细胞中通过激活PI3K途径能够调节迁移行为。此外,在动物模型实验中,在沉默GAB2的小鼠模型中,缺乏GAB2的细胞迁移能力明显降低,从而小鼠乳腺癌发生肺转移的比例降低。体外实验证实,GAB2促进了神经胶质细胞的迁移,GAB2表达降低后,细胞的迁移能力也随之降低。通过对乳腺癌、卵巢癌、白血病、黑色素瘤和胃癌等的研究,GAB2普遍被认为是一种潜在原癌基因。近来据报导GAB2在胶质瘤细胞中的高表达,GAB2在胶质瘤中过度表达的原因及如何下调其在胶质瘤组织中的表达,至今仍未完全阐明。microRNA是一类短链的非编码单链RNA分子,一般包括18至25个核苷酸,属于进化保留的非编码RNA,microRNA有重要的调控基因的作用,能够通过与3’非翻译区(3’-UTR)结合并调节目标mRNA,调节转录及转录后基因,包括翻译抑制或者对靶mRNA的降解,即使microRNA表达的微小变化,也能对数以百计的mRNA表达产生重大的调控作用。microRNA在许多生物过程中越来越多地被证实为关键的调节因子。在众多地microRNA中,转录自基因组染色体1 p13.3的区域的microRNA-197(miR-197),在许多疾病中出现了明显的异常调控,如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、大肠癌、甲状腺癌、前列腺癌及甲状腺滤泡癌等。此外越来越多的证据显示,miR-197与特定的RNA种类相互作用,在细胞增殖、分化、凋亡、迁移、耐药性等方面发挥了至关重要的作用。近来,有关文献报道了 microRNA对人类胶质瘤表型的调控作用。例如,microRNA-21的表达下调导致体内的胶质瘤发生生长紊乱,并且显示出与胶质瘤中神经前体细胞具有协同细胞毒性作用,这些前体细胞在人脑胶质瘤细胞中运送分泌型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;microRNA-34a在脑肿瘤和胶质瘤干细胞中担当肿瘤抑制因子的作用;microRNA-181a通过靶向Bcl-2增加人类恶性胶质瘤U87MG细胞对放射治疗的敏感性。尽管miR-197在许多肿瘤中出现表达异常,但它在胶质瘤中的表达水平及功能仍知之甚少。越来越多的研究证实,GAB2表达水平与胶质瘤WHO分级有关且与胶质瘤的侵袭相关,WHO分级越高,GAB2表达越高。而miR-197在胶质瘤中的表达水平及功能,miR-197和GAB2在胶质瘤发生、发展、侵袭性等方面是否具有相互作用,更鲜见有文献报导。阐明miR-197和GAB2在胶质瘤发生、发展、侵袭等是否具有相关性,有助于我们更深入的理解胶质瘤的发病和发展的机理,或可作为判断胶质瘤预后的一个有用的标志物,并可作为一种新的胶质瘤侵袭干预的治疗靶点。目的本研究先检测miR-197及GAB2在胶质瘤组织中的表达水平,在人胶质瘤细胞系A172细胞中分别验证miR-197与GAB2的细胞功能,并探讨miR-197与GAB2是否具有相关性及相互作用,进一步检测两者可能的相互作用位点。1、本研究选取人胶质瘤标本及对应扩大切除后脑组织,分别检测miR-197及GAB2的表达水平,进一步验证在胶质瘤中miR-197及GAB2表达水平。2、培养胶质瘤A172细胞并传代,分别以pre-miR-197(miR-197前体)及GAB2质粒转染,并设相应对照,分别检测miR-197与GAB2在A172中的细胞功能,探讨在胶质瘤细胞中miR-197表达水平与GAB2的表达是否具有相关性及相互作用,阐明miR-197与GAB2的表达之间的调控与胶质瘤发生、发展等的关系。3、预测并检测miR-197与GAB2可能的相互作用位点,探讨胶质瘤靶向治疗的新靶点的可行性,为胶质瘤治疗提供可能的新的治疗方法。方法1、选取胶质瘤标本及对应扩大切除后脑组织;培养并传代A172细胞,分别以pre-miR-197及GAB2质粒转染;分别设对照miR转染及空载体质粒转染A172细胞作为对照。RT-qPCR验证pre-miR-197转染的效率,Western blot分析验证GAB2质粒转染效率。2、以原位杂交法检测miR-197在胶质细胞瘤组织及其对应扩大切除后脑组织样本之间的表达差异。3、pre-miR-197转染及对照miR转染的A172细胞,分别采用细胞计数分析、集落形成实验验证miR-197对A172细胞增殖及细胞集落形成的影响;细胞周期分析检测两组细胞之间细胞分期差异;BrdU掺入实验验证miR-197对A172细胞中DNA合成的影响;Western blot进一步验证A172细胞中,miR-197对增殖标记物的蛋白表达水平的影响。4、随机选取部分胶质细胞瘤组织及扩大切除后脑组织,以Western blot法检测GAB2在两者之间的表达差异,免疫组化法检测GAB2在胶质瘤组织切片中的蛋白表达水平,并探讨与胶质瘤级别的相关性。以不同剂量(1nM、10nM、40nM)的表达GAB2质粒转染A172细胞,MTT法在不同时间点测定A172相对数量,推测GAB2与细胞增殖的相关性,以及是否与剂量相关。5、MiR-197及GAB2相互作用检测(1)在被pre-miR-197和对照miR转染的A172细胞中,Western blot检测GAB2蛋白表达水平;RT-qPCR检测A172细胞中GAB2 mRA表达水平;免疫荧光分析检测GAB2抗体免疫荧光染色强度。(2)以表达GAB2质粒和空载体质粒转染的A172两组细胞中,RT-qPCR、Northern blot及microRNA微阵列芯片技术分别检测miR-197表达水平的差异。(3)MTT及BrdU验证共转染的A172细胞的增殖活性差异:以GAB2质粒和空载体质粒转染的两组A172细胞中,分别以pre-miR-197转染,转染后细胞分别命名为GAB2/Pre-miR-197及Vector/Pre-miR-197组;MTT法及BrdU分析检测两组细胞增殖活性的差异。再以pre-miR-197与对照miR转染的两组A172细胞中,分别以表达GAB2质粒转染,转染后分别命名为Pre-miR-197/GAB2及control-miR/GAB2组;MTT法及BrdU分析检测两组细胞增殖活性的差异。6、探索miR-197在GAB2的靶向位点(1)TargetScan预测miR-197在GAB2 mRNA可能的结合位点。(2)荧光素酶报告基因分析:根据预测结合位点,构建含有miR-197在GAB2 mRNA可能结合位点的定向序列的野生型荧光素酶报告质粒(Wild-type-GAB2-WT-luc);取 pre-miR-197 与对照 miR 分别转染的两组 A172细胞,以上述质粒转染两组A172细胞后进行报告基因分析,验证miR-197是否影响荧光素酶活性。如miR-197能够抑制某种质粒荧光素酶活性,以该质粒所包含的对应位点的GAB2野生型荧光素酶基因作为模板,使用Quik Change Mutagenesis kit(快速变化突变试剂盒)使相应位点部分碱基发生突变,再构建包含结合位点突变后的GAB2突变型荧光素酶报告质粒(GAB2-MUT-luc),再分别转染上述两组A172细胞,验证miR-197能否抑制该质粒荧光素酶活性,从而推断miR-197在GAB2 mRNA具体靶向位点。(3)缺少相应结合位点的GAB2质粒分别转染pre-miR-197与对照miR转染的两组A172细胞,Western blot分析检测两组细胞中GAB2表达的差异。7、统计分析:每一项实验都至少重复三次。所有结果均表示为平均值±标准差。均数之间的差异均采用t检验或x 2检验分析,所有的统计分析均使用SPSS 16.0软件,P<0.05表示差异有统计学意义。结果1、RT-qPCR证实:与对照组中以对照miR转染相比,pre-miR-197转染的A172细胞中miR-197表达水平显著升高(P<0.01),说明pre-miR-197能高效转染A172细胞;Western blot证明,与空载体质粒转染相比,表达GAB2的质粒显著提高了 A172细胞中GAB2蛋白表达水平,表达GAB2的质粒能高效转染A172细胞。2、原位杂交法分析显示,与对应扩大切除后脑组织样本相比,miR-197在胶质细胞瘤组织本标中表达水平被显著下调(p<0.05)。3、细胞计数实验显示,与未处理组或对照miR处理的对照组相比,在被pre-miR-197转染的A172细胞中,细胞活性比率在每一个时间点明显低于另外两组(P<0.01)。细胞周期分析显示被pre-miR-197转染的A172细胞表现出较低的S期比例(p<0.05);集落形成实验表明,在被pre-miR-197或对照miR转染的A172细胞中,大于50细胞的集落计数,两组之间存在显著差异(P<0.01),miR-197在A172细胞显著抑制集落形成;BrdU掺入实验显示pre-miR-197转染组与对照组中细胞中DNA的合成水平在24小时和48小时均存在显著差异(P<0.05),pre-miR-197转染组明显低于对照组。与对照miR转染组相比,Western blot显示 miR-197 显著下调了 PCNA,Rb,Ki67,CDK2,CDK4 和 E2F1 的表达水平(p<0.05)。4、Western blot证实与对应扩大切除脑组织标本相比,GAB2在胶质细胞瘤组织及邻近对应扩大切除脑组织标本之间的表达存在明显差异(p<0.05),GAB2的表达水平在大多数胶质细胞瘤标本中较高。免疫组化法中检测到:胶质瘤级别分别为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ级中的GAB2蛋白表达水平(++/+++)占百分比分别为23.68%、38.46%、59.09%和75.0%。GAB2在各级别胶质瘤中的表达水平差异有统计学意义(x2=24.053,P<0.001),胶质瘤分级越高,GAB2的表达水平越高:Ⅰ 级 vs.Ⅱ级(P<0.05);Ⅱ 级 vs.Ⅲ 级(P<0.05);Ⅲ 级 vs.Ⅳ 级(P<0.05)。MTT法检测以不同剂量(1nM、10nM、40nM)的表达GAB2质粒转染的A172细胞数量存在明显差异,GAB2质粒剂量越大,A172细胞相对数量越多。5、miR-197与GAB2的相互作用(1)在被pre-miR-197和对照miR转染的A172两组细胞中,Western blot检测到GAB2蛋白表达水平在pre-miR-197转染组中显著下调(p<0.05)。免疫荧光分析测定表明,GAB2抗体免疫荧光染色强度在两组之间存在显著差异(P<0.01),pre-miR-197转染组GAB2水平明显低于对照组。RT-qPCR证实在两组细胞中,GAB2mRNA表达水平无明显差异(P>0.05)。(2)以表达GAB2质粒和空载体质粒转染的A172两组细胞中,Northern blot分析显示miR-197表达水平在两组间存在明显差异(p<0.05),在GAB2质粒转染组明显低于空载质粒转染组,RT-qPCR证实miR-197表达水平在两组间有显著差异(P<0.01),在GAB2质粒转染组中明显下调。microRNA微阵列分析显示,miR-197表达水平在GAB2质粒转染组中表达水平明显减低。(3)MTT 法及 BrdU 分析结果共同证实:GAB2/Pre-miR-197 及 empty-Vector/Pre-miR-197组两组细胞中,A172细胞增殖活性有显著差异(P<0.01),GAB2/Pre-miR-197 组明显高于 empty-Vector/Pre-miR-197 组;Pre-miR-197/GAB2及control-miR/GAB2两组A172细胞之间无显著差异(P>0.05)。6、miR-197在GAB2的靶向位点(1)TargetScan 程序预测 miR-197 靶向 GAB2 mRNA 的 3’-UTR 共 3 个可能位点,分别位 3885-3891、1151-1158、2044-2050。(2)荧光素酶报告基因分析结果证实,荧光素酶报告以三个位点定向序列实施,构建 Wild-type-GAB2-WT-luc-1(包含 3885-3891 位点)、GAB2-WT-luc-2(包含1151-1158位点)和GAB2-WT-luc-3(包含2044-2050位点)三种荧光素酶质粒。三种荧光素酶质粒分别引入pre-miR-197与对照miR分别转染的两组A172细胞细胞后,GAB2-WT-luc-1及GAB2-WT-luc-3荧光素酶活性在两组细胞中无显著差异差别(P>0.05);而GAB2-WT-luc-2质粒荧光素酶活性在两组细胞中有明显差异(p<0.05),pre-miR-197转染组明显低于对照miR转染组。在使1151-1158位点中四个碱基突变后,构建GAB2-MUT-luc-2(突变型)质粒,GAB2-MUT-1uc-2质粒引入两组细胞后,荧光素酶活性在两组中无明显差别(P>0.05)。(3)缺少预测的3’-UTR的GAB2质粒分别转染pre-miR-197与对照miR转染的两组A172细胞,Western blot分析检测两组细胞中,GAB2表达无明显差异(p>0.05)。结论1.miR-197的表达在胶质瘤细胞中被下调,miR-197在A172细胞中抑制了细胞的增殖。2.在胶质瘤细胞中,GAB2表达被上调并且与胶质瘤级别呈正相关,在A172细胞中GAB2促进了细胞的增殖。3.miR-197在胶质瘤组织细胞中的表达被GAB2显著抑制,在A172细胞中,pre-miR-197转染后造成的miR-197的过度表达下调了 GAB2的表达;GAB2质粒转染后造成的GAB2的过度表达抑制了 miR-197的表达,并进一步促进了细胞的增殖。4.在 A172 细胞中,miR-197 通过靶向 GAB2 mRNA 的 3’-UTR 1151-1158 位点,抑制GAB2蛋白表达,但GAB2mRNA表达水平未受影响。5.在胶质瘤治疗中,GAB2作为miR-197的靶蛋白,通过恢复或增加miR-197的表达,从而下调GAB2的表达,抑制肿瘤细胞的增殖,降低胶质瘤细胞的侵袭性,代表着大有前景的胶质瘤新的靶向治疗的方法。