【摘 要】
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[目的]制备不同电荷阳离子DOTAP修饰的流感疫苗脂质体,考察其理化性质、免疫原性、稳定性和安全性。[方法]1.以大豆卵磷脂和胆固醇,阳离子DOTAP和中性磷脂DOPC（DOTAP和DOPC不同质量比为4:1,3:2,2:3,1:4）为膜材,通过薄膜分散法联合冻融-冻干法制备电荷修饰的流感疫苗脂质体冻干粉,以粒径、Zeta电位、包封率为考察指标。2.将昆明种小鼠分为PBS组、疫苗原液组、阳离子组（
【基金项目】
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云南省生物医药-重大科技专项基金,云南省自然科学基金项目（2018ZF006）:《新型佐剂脂质体和多价流感病毒疫苗的临床前研究》；
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[目的]制备不同电荷阳离子DOTAP修饰的流感疫苗脂质体,考察其理化性质、免疫原性、稳定性和安全性。[方法]1.以大豆卵磷脂和胆固醇,阳离子DOTAP和中性磷脂DOPC（DOTAP和DOPC不同质量比为4:1,3:2,2:3,1:4）为膜材,通过薄膜分散法联合冻融-冻干法制备电荷修饰的流感疫苗脂质体冻干粉,以粒径、Zeta电位、包封率为考察指标。2.将昆明种小鼠分为PBS组、疫苗原液组、阳离子组（4:1、3:2、2:3、1:4）、中性脂质体组,腹腔免疫小鼠7、14和28天后,以原液组为阳性对照组,PBS组为阴性对照组,采用MTT法检测脾淋巴细胞增殖,采用流式细胞术检测小鼠T淋巴细胞CD4+/CD8+比值评价细胞免疫原性。3.将昆明种小鼠分为PBS组、疫苗原液组、阳离子组（4:1、3:2、2:3、1:4）、中性脂质体组、空白组,腹腔免疫小鼠3、7、14、28、42、56天后,以空白未给药组为免前对照,采用微量血凝抑制法检测小鼠血清的抗体滴度比,评价体液免疫原性。4.将阳离子4:1组脂质体冻干粉、混悬液置于4℃、25±2℃（60%±5%）和40±2℃（75%±5%）条件下进行稳定性试验,以包封率、刺激指数、抗体滴度比为指标考察稳定性,MTT实验和血凝抑制试验动物分组为PBS组、疫苗原液组、阳离子4:1组、中性脂质体组,免疫时间为7天。5.将昆明种小鼠分为PBS组、疫苗原液组、4:1组和中性脂质体组,雌雄各半,腹腔免疫14天,以原液组为阳性对照,PBS组为阴性对照,通过异常毒性实验,观察小鼠的体重变化、脏器指数、血液指标进行安全性评价。[结果]1.DOTAP:DOPC比例分别为1:4、2:3、3:2、4:1的四组脂质体流感疫苗平均粒径分别为437.32nm、475.03nm、485.81nm、529.65nm;zeta电位分别为 1.59mV、5.31mV、7.93mV、12.05mV;包封率分别为89.00%、89.15%、86.07%、81.82%。2.淋巴细胞增殖实验结果表明,与PBS组比较,四个阳离子脂质体组在7、14、28天的SI值较高具有统计学差异（P<0.05）;与原液组比较,四个阳离子脂质体组在7天和28天时SI值有统计学差异（P<0.05）。流式细胞术检测小鼠CD4+/CD8+比值,结果表明四个阳离子脂质体组与PBS组比较具有统计学差异（P<0.05）,14天和28天时与各组比较均有统计学差异（P<0.05）。3.血凝抑制实验结果显示免疫3天时原液组、4:1组抗体滴度比大于等于4;7天时原液组、4:1组、3:2组和中性组抗体滴度比大于等于4,4:1组与原液组、中性组具有统计学差异（P<0.05）;免疫14、28、42、56天时各组的抗体滴度比均大于等于4。4.物理稳定性结果显示,在4℃、25±2℃（60%±5%）、40±2℃（75%±5%）条件下储存,脂质体冻干粉包封率变化小,外观无明显变化。生物稳定性结果显示,在4℃条件下储存15天时4:1组的SI值与PBS组、中性组具有统计学差异（P<0.05）,60、120天时4:1组与PBS组具有统计学差异（P<0.05）。15、30、60、120天时4:1组免前与免后抗体滴度比大于4。在25±2℃（60%±5%）条件下储存15天4:1组的SI值与PBS组、原液组具有统计学差异（P<0.05）,60、120天4:1 组与PBS组具有统计学差异（P<0.05）。15、30、60天4:1组免前与免后抗体滴度比大于4。在40±2℃（75%±5%）条件下储存15天4:1组的SI值与PBS组和中性组有统计学差异（P<0.05）且抗体滴度比大于4。5.异常毒性结果显示,小鼠在观察期内全部存活,体重正常增长。与PBS组比较,雌雄鼠阳离子组血小板数、粒细胞数和平均血小板体积均无统计学差异。雌鼠白细胞、淋巴细胞、血红蛋白含量与PBS组,原液组均有统计学差异（P<0.05）,雄鼠均无统计学差异。雌雄鼠4:1组的心、肝、肺、胸腺、肾、脑与原液组相比无统计学差异。[结论]DOTAP和DOPC不同质量比为4:1、3:2、2:3、1:4制备的阳离子脂质体佐剂具有良好的稳定性,能够诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫,并且在小鼠身上展现出了良好的安全性,以电荷高于10的阳离子4:1组免疫效果最佳。
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