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研究背景:随着人类生活水平的提高和老龄社会的到来,糖尿病的发病率逐年增高,其并发症糖尿病足和截肢所带来的医疗耗费巨大,给社会带来沉重的经济负担。传统治疗主要是内科的药物治疗、外科的手术治疗及介入治疗进行血流重建,疗效均不够理想。干细胞移植这项新技术在此领域的临床应用得到越来越多的关注,给糖尿病足的治愈提供了新方法。第一部分糖尿病动物模型的制作目的:本实验选用四氧嘧啶(ALX)诱导糖尿病动物模型,探索一种安全、稳定、动物低死亡率的糖尿病模型建立方法。方法:健康新西兰兔20只,随机分为A、B两组,每组10只。两组给药前均禁食12小时,A组为一次给药法组,即按150mg/ kg经耳缘静脉快速注射新鲜配置的5%ALX;B组为两次给药法组,第1次给药,按80mg/ kg经耳缘静脉快速注射新鲜配置的5%ALX,24小时后第2次给药,按120mg/ kg再次经耳缘静脉快速注射新鲜配置的5%ALX。14天后测空腹血糖值,以空腹血糖>16mmol/L作为造模成功的标准。结果:A组48小时内死亡4只,第3天死亡2只,第5天死亡1只,死亡率70%,1只血糖短暂升高,两周后恢复正常,2只达到糖尿病模型标准,成模率20%;B组48小时内死亡1只,死亡率10%,1只血糖短暂升高,两周后恢复正常,8只达到糖尿病模型标准,成模率80%。结论:1.ALX连续2次小剂量给药法优于1次性高剂量给药,降低了死亡率,提高了成模率。2.应用ALX制备糖尿病模型,是一种经济、安全、可靠的方法。第二部分糖尿病兔骨髓干细胞动员及影响目的:通过监测健康兔、糖尿病兔及未成模兔三组应用相同剂量粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后的外周血单个核细胞数、骨髓单个核细胞数及骨髓粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)培养计数,对比三组的动员效果有无差别,以探讨糖尿病对骨髓干细胞动员有无影响。通过比较糖尿病动物模型在动员前后血红蛋白、血小板、空腹血糖、血液流变学等各项指标的变化情况,探讨骨髓干细胞动员对糖尿病的影响。方法:健康新西兰兔,随机分为A、B、C三组。A组为健康兔10只,B组为糖尿病兔10只,C组为未成模兔5只(ALX剂量同B组)。A、B、C三组在动员前分别测外周血单个核细胞数,然后三组分别皮下注射10ug/kg G-CSF进行动员,每天1次,连续5天。在应用G-CSF动员期间,每天检测三组外周血单个核细胞数,观察各组动员效果,动员第6天检测三组外周血单个核细胞数,同时三组均抽取骨髓液3ml,分离骨髓单个核细胞,检测骨髓单个核细胞数,并进行CFU-GM培养。B组(糖尿病组)中的10只糖尿病兔在动员前及动员第6天分别监测血红蛋白、血小板、空腹血糖、血液流变学变化情况。结果:1.动员前三组外周血单个核细胞数无差别。动员后三组外周血单个核细胞均较前明显升高,计数比较无统计学差异。动员后三组骨髓单个核细胞数计数比较无差别。2.CFU-GM培养发现,三组均在培养的5～6天开始有集落形成,以后数目逐渐增多,大约12天达高峰,此后集落不断增大,总的集落数不再增加,三组集落培养计数无差别。3.动员前后10只糖尿病兔的晨空腹血糖值有一定的下降趋势,血红蛋白、血小板均有所升高,但变化均无统计学差异。10只糖尿病兔的晨空腹血流变中的血浆粘度及红细胞聚集性动员前后无明显变化;全血粘度动员后较动员前均明显升高。结论:1.糖尿病对骨髓干细胞动员效果无影响。2.应用G-CSF骨髓干细胞动员对糖尿病兔的血糖、血红蛋白、血小板无影响,对血流变有影响,提示临床应予重视并干预。第三部分自体骨髓干细胞移植治疗兔糖尿病下肢缺血性疾病目的:对比骨髓干细胞移植、皮下注射G-CSF、骨髓干细胞移植联合G-CSF皮下注射三种方法对缺血组织血管新生的作用效果。方法:健康新西兰兔40只,以第一部分中介绍的二次给药法,用ALX诱导成为糖尿病兔后,均结扎右后肢股动脉,建立糖尿病下肢缺血动物模型,随机分成A、B、C、D四组,每组10只。A组:模型建立后,开始皮下注射10ug/kg G-CSF进行动员,每天1次,连续5天。B组:如A组方法动员,并于动员第6天采髓5ml,分离骨髓单个核细胞。以右侧股内侧正中部位为中心等距离分10个位点,用1ml注射器依次等量肌肉注射0.1ml骨髓单个核细胞悬液(其中5×106个骨髓单个核细胞/位点),每一实验动物局部移植的骨髓单个核细胞总数量为5×107个。C组:模型建立后,不进行动员直接采髓10ml,右侧股内侧肌肉注射骨髓单个核细胞,注射方法同B组。D组:模型建立后,不进行动员,右侧股内侧肌肉注射PBS,注射方法同B组。术后第28天全麻,4组均以右侧股内侧正中部位为中心等距离取局部肌肉组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,制作切片,免疫组化染色,检测各组骨骼肌微血管密度及血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达水平。结果:1.单纯用G-CSF治疗或单纯骨髓干细胞移植治疗,均能使局部缺血组织微血管数量增加。G-CSF动员后再配合骨髓干细胞移植治疗对血管新生的作用更加显著,局部缺血组织微血管数量增加更明显。2.单纯用G-CSF治疗或单纯骨髓干细胞移植治疗,均能使局部缺血组织VEGF的表达量增加。G-CSF动员后再配合骨髓干细胞移植治疗对血管新生的作用更加有效,VEGF的表达量增加更明显。结论:1.单纯G-CSF动员骨髓干细胞能取得单纯自体骨髓干细胞移植相似的促血管新生作用。2.G-CSF动员后再配合骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血性疾病,其效果明显优于单纯用G-CSF治疗和单纯的骨髓干细胞移植治疗。