【摘 要】
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目的:我们前期发现CKD患者萎缩性骨骼肌中存在自噬活跃现象。本课题拟进一步探讨自噬在CKD肌萎缩中的作用及其机制,并进一步探讨饮食干预（低蛋白饮食+α-酮酸）对CKD骨骼肌自噬和肌萎缩的影响。方法:利用SD大鼠建立5/6肾切除CKD模型,给予自噬抑制剂渥曼青霉素（Wort）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）干预,并设置相应对照组,8周后分离腓肠肌进行相关实验。饮食干预实验中,5/6肾切除大鼠随机分为3组
【基金项目】
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国家自然科学基金青年项目（项目号81300611）；
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目的:我们前期发现CKD患者萎缩性骨骼肌中存在自噬活跃现象。本课题拟进一步探讨自噬在CKD肌萎缩中的作用及其机制,并进一步探讨饮食干预（低蛋白饮食+α-酮酸）对CKD骨骼肌自噬和肌萎缩的影响。方法:利用SD大鼠建立5/6肾切除CKD模型,给予自噬抑制剂渥曼青霉素（Wort）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）干预,并设置相应对照组,8周后分离腓肠肌进行相关实验。饮食干预实验中,5/6肾切除大鼠随机分为3组:正常蛋白饮食组（NPD）;低蛋白饮食组（LPD）,低蛋白饮食+α-酮酸组（LPD+KA）,并设相应对照组。24周后分离腓肠肌进行相关实验。细胞实验中,在大鼠L6成肌细胞中转染CAPN6质粒,观察自噬相关蛋白LC3和P62的m RNA和蛋白表达;转染m RFP-GFP-LC3腺病毒观察LC3红绿荧光的变化以判断自噬及自噬流的情况。进一步,细胞给予无亮氨酸培养基或者不同浓度（10m M、50m M）的亮氨酸培养基培养,通过质粒转染调节CAPN6表达水平,观察LC3、P62以及m TORC1相关蛋白包括m TOR、raptor蛋白的表达变化以及p-p70s6k1/p70s6k1、p-4EBP1/4EBP1比值变化。结果:与CKD对照组相比,自噬抑制剂尤其是3-MA干预显著改善CKD大鼠肌纤维横截面积,增加CKD大鼠体质量和腓肠肌质量。自噬抑制剂Wort和3-MA显著减少CKD大鼠炎症小体以及炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6的蛋白表达。与CKD对照组相比,自噬抑制剂组线粒体DNA（mt DNA）释放到胞浆减少,但总mt DNA并没有明显减少。LPD+KA饮食改善CKD大鼠体质量和腓肠肌质量。机制研究发现,LPD+KA饮食缓解NPD大鼠的自噬活跃,但对ROS、NALP3炎症小体、Caspase-1和mt DNA释放均无明显影响。在大鼠L6成肌细胞,CAPN6增加m TORC1的表达及活性,抑制自噬相关蛋白LC3和P62的m RNA和蛋白表达,减少细胞自噬。亮氨酸促进细胞中CAPN6的表达并抑制自噬。结论:自噬和线粒体自噬活跃在CKD骨骼肌萎缩中发挥了重要作用。利用自噬抑制剂干预自噬,减少mt DNA释放到胞浆,部分缓解CKD肌肉炎症和肌萎缩。LPD+KA饮食可抑制NPD大鼠自噬,改善骨骼肌萎缩。亮氨酸通过增加CAPN6表达,进而促进m TORC1的蛋白表达及活性,发挥抑制自噬的作用。
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