目的:大肠癌是一种世界性肿瘤,也是中国发病率上升最快的消化道恶性肿瘤。目前对于大肠癌的治疗主要手段仍为手术切除,早期大肠癌的预后相对较好,但多数患者就诊时已属晚期,且大多数患者已经发生转移。转移性大肠癌是癌症相关死亡最常见的原因之一,关于其发生发展机制的研究,受到研究者的广泛关注。大肠癌的转移,受到多种因素的影响,其中血管新生和自身转移在大肠癌的快速生长和转移过程中起着举足轻重的作用。肿瘤早期因其生产缓慢,消耗的氧气和营养物质极少,因而较少发生血管新生。若肿瘤早期没有发生血管新生,其瘤体生长不会超过3mm~3。肿瘤后期,随着肿瘤细胞的不断生长,瘤体不断增大,导致肿瘤内部缺乏氧气和营养物质,这种缺氧以及营养缺乏的细胞外环境能刺激肿瘤细胞分泌多种血管新生相关因子和其他物质,诱导新血管的生成和肿瘤自身转移,为肿瘤内部细胞的快速生产提供充足的氧气和营养物质。在转移性大肠癌中,缺氧环境下,大肠癌细胞究竟通过何种机制新生血管和转移,对于抗肿瘤靶向药物的研发至关重要。外泌体是一种起源于胞内多囊体、由细胞主动分泌的大小约30nm-100nm的脂质双分子层小囊泡,几乎所有细胞均能产生外泌体。肿瘤细胞在其发生、发展的过程中不断释放肿瘤特异性的外泌体到胞外,并可通过其携带的肿瘤细胞的DNA,RNA及蛋白质等生物物质调节催化肿瘤微环境。研究发现,肿瘤细胞来源的外泌体可以刺激血管的再生和自身转移,主要通过内皮细胞和正常细胞对肿瘤细胞来源的外泌体的摄取来完成,尤其在肿瘤组织缺氧刺激外泌体生成增加的情况下。证据表明,大肠癌细胞来源的外泌体在大肠癌侵袭,转移,血管新生及免疫调节等生物学行为中通过其携带的小RNA,信使RNA或蛋白等物质产生重要作用。但是,缺氧大肠癌细胞来源的外泌体的对癌症的功能和机制目前仍未见很多报道。多种信号通路参与肿瘤血管生成和转移,其中Wnt/β-catenin通路变化在多种癌症中的作用被陆续报道。激活的Wnt蛋白会进一步募集Axin蛋白,将后者从抑制性复合体转变为刺激性信号小体,进一步促进下游蛋白发挥作用。Wnt家族的多种蛋白参与了肿瘤的发生发展。但Wnt家族蛋白在外泌体中对大肠癌促进血管生产和转移的分子机制仍需要进一步探索。本研究拟对缺氧大肠癌细胞来源的外泌体促进大肠癌血管新生和转移的机制进行进一步探讨,通过与血管内皮细胞共培养,常氧细胞共培养等方式,通过CCK8,transwell实验,划痕实验等多种手段,证实缺氧大肠癌来源的外泌体对大肠癌血管新生和转移的作用。在此基础上,深入探讨的Wnt/β-catenin通路是否在其中发挥作用,通过体外细胞实验和体内动物实验,明确缺氧大肠癌细胞来源的外泌体对肿瘤血管新生和转移的作用。为进一步研发抗肿瘤药物奠定基础。研究方法:本研究首先选取HT29和HCT116两种大肠癌细胞系,进行常氧和缺氧培养,提取外泌体后,与血管内皮细胞共培养,利用CCK8检测血管内皮细胞的增殖能力变化,Transwell实验检测迁移能力变化,接下来抑制外泌体表达后,同样构建外泌体-血管内皮细胞体系,观察增殖和迁移能力是否随外泌体的减少而发生变化。在细胞内调控Wnt-β-catenin的激活状态,证实此通路在缺氧大肠癌外泌体促进的血管新生中的作用。在缺氧大肠癌细胞来源外泌体中筛查促血管生成因子,通过敲低此因子等手段,明确此因子是否介导了血管内皮细胞的增殖和迁移,明确此因子的增高是否缺氧相关。同时,进行缺氧大肠癌来源外泌体与常氧大肠癌细胞共培养,验证上述关键分子在常氧大肠癌细胞侵袭和转移的中的促进作用,明确Wnt-β-catenin通路在此过程中的作用。结果:1.缺氧大肠癌细胞来源的外泌体诱导内皮细胞的增殖和迁移能力增加。2.抑制大肠癌细胞的外泌体分泌抑制内皮细胞的增殖和迁移。3.缺氧大肠癌来源的外泌体通过Wnt4增加内皮细胞的增殖和迁移能力。4.低氧以HIF-1α相关的方式刺激外泌体的Wnt4上调。5.内皮细胞的增殖和迁移需要外泌体的Wnt4激活β-catenin信号通路。6.缺氧大肠癌细胞来源的外泌体增加了常氧大肠癌细胞的迁移和侵袭能力。7.抑制大肠癌外泌体分泌降低了缺氧大肠癌细胞来源的外泌体所诱导常氧大肠癌细胞的迁移和侵袭的增加。8.缺氧大肠癌细胞来源的外泌体诱导常氧大肠癌细胞的迁移和侵袭的增加依赖于HIF1α。9.外泌体Wnt4促进缺氧大肠癌细胞来源的外泌体所诱导的迁移和侵袭。10.外泌体Wnt4激活的β-catenin是常氧大肠癌细胞迁移和侵袭增强所必需的。11.体内实验证实缺氧大肠癌细胞来源的外泌体Wnt4促进了大肠癌的生长和血管生成。结论:1.缺氧的大肠癌细胞释放的外泌体能促进血管内皮细胞的增殖和迁移。此外泌体含有丰富的Wnt4。外泌体的Wnt4在内皮细胞中增加了β-catenin的核转位。β-catenin信号通路的激活对血管内皮细胞的增殖和迁移的至关重要。在体内动物研究进一步揭示影响缺氧大肠癌细胞来源的外泌体具有促进肿瘤生长和血管形成的作用。即:缺氧条件下,大肠癌细胞通过外泌体介导的Wnt/β-catenin信号通路促进内皮细胞的血管生成,这可能是对大肠癌治疗的新靶点。2.缺氧大肠癌细胞释放的外泌体增强了常氧大肠癌细胞的迁移和侵袭能力。缺氧大肠癌来源的外泌体通过Wnt4增强常氧大肠癌细胞迁移和侵袭能力。外泌体Wnt4增强了常氧大肠癌细胞中β-catenin的核转位。Wnt-β-catenin信号通路的激活对于常氧大肠癌细胞的迁移和侵袭增强至关重要。即:缺氧可以刺激肿瘤细胞释放富含Wnt4的外泌体,然后由含氧量正常的细胞内吞以促进转移。本研究可能为大肠癌,尤其是转移性大肠癌的治疗提供新的靶点。