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背景和目的: 2,3,7,8-四氯代二苯-并-二噁英(TCDD)是一种典型的持久性环境有机污染物,具有较强的脂溶性,难降解性,急性或大剂量暴露可对人类及动物的神经系统造成损害,影响其学习记忆能力。目前认为海马在学习记忆过程中起到非常重要的作用,前期通过多种实验也证实TCDD对海马的影响与学习记忆能力的下降有密切关联,但具体影响机制尚不完全明确。本研究在前期研究的基础上,探索亚慢性接触TCDD对大鼠海马区学习记忆相关蛋白NMDAR2B和CREB的影响,以进一步揭示TCDD的神经毒性作用机理。 材料和方法: 选取1月龄SD大鼠120只,随机分为4组,每组30只,雌雄各半。设3个TCDD剂量组(2ng/kg/日,10ng/kg/日,50ng/kg/日),一个对照组(玉米油)。13周后取大鼠双侧海马组织进行免疫组织化学,检测海马各区NMDAR2B、p-CREB和CREB蛋白表达;进行Western Blot实验,检测三种蛋白在海马组织中的含量。数据经正态性检验后,采用单因素方差分析、协方差分析、两独立样本t检验和Wilcoxon秩和检验进行分析,组间多重比较采用LSD法。P≤0.05表示差别有统计学意义。 结果: 1亚慢性TCDD染毒大鼠基本情况 TCDD处理组未发现明显的毒性反应,大鼠体重在各组间差别均没有统计学意义。 2免疫组织化学实验 形态观察:镜下可见各组大鼠海马均有大量免疫反应阳性神经元,CREB和p-CREB主要定位于神经细胞胞核,呈棕黄色。NMDAR2B阳性反应定位于细胞膜上,呈棕黄色。 2.1 NMDAR2B免疫组织化学数据分析结果 CA1区各组间分析结果:10ng/kgTCDD和50ng/kg TCDD组NMDAR2B表达低于对照组(P<0.05)和2ng/kgTCDD组(P<0.05),但对照组和2ng/kgTCDD组之间,10ng/kg和50 ng/kgTCDD组之间差别无统计学意义(P>0.05)。 CA3区各组间分析结果:50ng/kg TCDD组免疫阳性表达均低于对照组(P<0.05)和2ng/kgTCDD组(P<0.05),对照组和2ng/kgTCDD组以及10ng/kgTCDD组之间差别无统计学意义(P>0.05)。 海马CA2区、CA4区和DG区各剂量组之间NMDAR2B表达均显示差别无统计学意义(P>0.05),尚不能认为TCDD处理使NMDAR2B在这三区的表达有差别。 2.2 CREB免疫组织化学数据分析结果 CA1区各组 CREB表达情况:50ng/kg TCDD组低于对照组、2ng/kgTCDD组和10 ng/kgTCDD组(P<0.05),差别有统计学意义。但对照组、2ng/kgTCDD、10ng/kg TCDD组三组之间,差别无统计学意义(P>0.05)。 CA2区各组CREB表达情况:50ng/kg TCDD组CREB蛋白表达低于对照组(P<0.05),其他三组之间CREB表达无差别(P>0.05)。 CA3区各组CREB表达情况:50ng/kg TCDD组低于对照组(P<0.05)和2ng/kg TCDD组。对照组、2ng/kg TCDD组、10ng/kg TCDD组之间差别无统计学意义(P>0.05)。 海马 CA4区与DG区 CREB表达结果相同,即蛋白表达在各剂量组之间并无差异(P>0.05)。 2.3 p-CREB免疫组织化学数据分析结果 CA1区各组p-CREB表达情况:10 ng/kgTCDD和50 ng/kgTCDD蛋白表达均低于对照组(P<0.05),但对照组和2ng/kgTCDD组之间,10 ng/kgTCDD和50 ng/kgTCDD组之间差别无统计学意义(P>0.05)。 CA2区各组p-CREB表达情况:10ng/kgTCDD和50ng/kg TCDD组均低于对照组(P<0.05)和2ng/kgTCDD组(P<0.05),但对照组和2ng/kgTCDD组之间,10ng/kg和50 ng/kgTCDD组之间差别无统计学意义(P>0.05)。 海马CA3区50 ng/kg TCDD组p-CREB表达低于对照组(P<0.05),其他三组之间表达则未显示有差别(P>0.05)。CA4与DG区四组之间差别均无统计学意义(P>0.05)。 3 Western Blot实验结果 3.1 NMDAR2B WB数据分析结果 同一剂量组大鼠两性别CREB表达的结果显示,任一剂量组雌鼠与雄鼠之间相比,差别均无统计学意义(P>0.05)。 同一性别各组间 NMDAR2B蛋白表达比较发现:(1)雌性大鼠10ng/kgTCDD和50 ng/kgTCDD组蛋白表达低于对照组和2ng/kgTCDD组(P<0.05),而对照组和2ng/kgTCDD组之间,10ng/kgTCDD和50 ng/kgTCDD组之间差别无统计学意义(P>0.05)。(2)雄性大鼠50 ng/kgTCDD组蛋白表达显著低于其余三个 TCDD剂量组,差别有统计学意义(P<0.05);而对照组、2ng/kgTCDD组和10 ng/kgTCDD之间蛋白表达无差异(P>0.05)。 在不区分性别的整体组间比较中,10 ng/kgTCDD组和50 ng/kgTCDD组NMDAR2B蛋白表达均低于对照组和2ng/kgTCDD组,差别有统计学意义(P<0.05)。10 ng/kgTCDD组和50 ng/kgTCDD组之间,对照组和2ng/kgTCDD组之间,差别均无统计学意义(P>0.05)。 3.2 CREB WB数据分析结果 同一剂量组大鼠两性别CREB表达的比较显示,任一剂量组的雌鼠与雄鼠之间CREB蛋白表达相比,差别均无统计学意义(P>0.05)。 同一性别各组间CREB蛋白比较显示:雌性大鼠CREB蛋白表达在四个剂量组间无统计学差异(P>0.05)。雄性大鼠与雌性大鼠结果相同。 在不区分性别的整体组间比较中,对照组与三个TCDD剂量组之间差别均无统计学意义(P>0.05),不同剂量组间未显示CREB表达差异。 3.3 p-CREB WB数据分析结果 同一剂量组两性别p-CREB表达的比较:(1)对照组、2ng/kgTCDD组、10ng/kg组雌鼠与雄鼠p-CREB蛋白表达量相比,差别均无统计学意义(P>0.05);(2)50ng/kgTCDD组雄鼠p-CREB蛋白表达量低于雌鼠,差别有统计学意义(P<0.05)。 同一性别各组间p-CREB蛋白表达的比较:雌性大鼠四组之间相比,50ng/kg TCDD组低于其余三组,差别有统计学意义(P<0.05);雄性大鼠与雌性大鼠有相似趋势,也即50 ng/kg组蛋白表达最低(P<0.05)。 不区分性别的四组间比较中,50ng/kg TCDD组低于对照组(P<0.05);对照组、2ng/kgTCDD组、10ng/kg组之间,差别均无统计学意义;2ng/kgTCDD组、10ng/kg组与50ng/kgTCDD之间,也未显示有差别(P>0.05)。 3.4 WB实验p-CREB/CREB数据分析结果 同一剂量组两性别p-CREB/CREB比值的比较:(1)对照组、2ng/kgTCDD组、10ng/kg组雌鼠与雄鼠的比值相比,差别均无统计学意义(P>0.05);(2)50ng/kgTCDD组雄鼠p-CREB蛋白表达量占CREB总量低于雌鼠,差别有统计学意义(P<0.05)。 同一性别各组间p-CREB/CREB比值的比较:雌性大鼠四组之间相比,50ng/kg TCDD组低于其余三组,差别有统计学意义(P<0.05),而对照组、2ng/kgTCDD组、10 ng/kg组之间则显示无差别;雄性大鼠与雌性大鼠有同样趋势,也即50 ng/kg组两者比值最低(P<0.05)。 不区分性别的四组间比较中,50ng/kg TCDD组二者比值显著低于对照组、2ng/kg组、10ng/kg组(P<0.05),差别有统计学意义;而对照组、2ng/kg组与10ng/kg组之间,无统计学差异(P>0.05)。 结论: 亚慢性接触TCDD对成年大鼠学习记忆相关蛋白的功能发挥会产生一定的影响;这种影响显示在学习记忆巩固过程中,抑制NMDAR2B和p-CREB蛋白质的合成,尤在大鼠海马CA1和CA3区较明显。TCDD对大鼠学习记忆影响的机制推测可能是通过对NMDAR2B和p-CREB蛋白表达的抑制作用,从而对相关学习记忆通路产生影响,最终引起学习记忆能力下降。