乳腺癌是我国女性发病率最高、严重威胁女性健康和生命的恶性肿瘤,每年新发病例约138万,死亡病例约45万[1]。目前,乳腺癌常规治疗主要以手术切除,并行术后化疗、放疗、内分泌治疗、分子靶向治疗等。尽管目前的研究认为术后辅助治疗是预防复发和改善乳腺癌患者预后的重要手段,但常规的辅助治疗并无法让所有的乳腺癌患者获益[2]。乳腺癌患者中有15%的患者为三阴性乳腺癌,即雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体2(HER-2)均阴性。这部分患者在常规手术及化疗完成后,无法进行内分泌治疗、靶向治疗等辅助治疗,局部复发及远处转移率较高,是乳腺癌中预后最差的一种分子亚型[3]。因此,寻找新的适合三阴性乳腺癌患者的辅助治疗手段是目前亟需解决的焦点问题[4]。传统中医药及其提取物在预防肿瘤发生、抑制瘤灶形成、防止复发转移等方面有着独特的优势。槐耳是一种中药药用真菌,其主要有效成分为槐耳多糖[5]。目前已有其成品槐耳颗粒(国家一类新药)应用于多种临床恶性肿瘤的辅助治疗具有抗肿瘤作用,且能改善患者生活质量。已有实验研究证实,槐耳多糖对实验室培养的多种乳腺癌细胞系具有抑制和杀伤作用,但对三阴性乳腺癌患者化疗后应用槐耳多糖是否能改善乳腺癌患者的DFS和OS?其重要作用机制是什么?本课题拟对上述问题进行初步探讨。实验方法和结果1、槐耳颗粒用于三阴性乳腺癌术后治疗的临床研究:方法:陆军军医大学西南医院乳腺中心2010年10月-2014年9月期间三阴性乳腺癌病理分期为Ⅰ-Ⅲ期患者201例,随机分为服用槐耳颗粒组(实验组)和未服用槐耳颗粒组(对照组),中位随访46个月,观察患者的DFS和OS。结果:实验组101例患者中,有13例(12.9%)患者疾病发生进展,其中死亡患者10例(9.9%),除1例患者为非正常原因死亡外,其余患者均因疾病进展死亡。对照组100例患者中,有18例(18.0%)患者发生疾病进展,其中死亡患者14例(14.0%)。实验组与对照组5年总DFS比为87.1%VS 82%,两组间无统计学差异(P=0.396),5年总OS比为90.1%VS 86%,两组间无统计学差异(P=0.396)。但亚组分析中发现,在Ⅲ期患者中5年总实验组与对照组DFS分别为81.3%VS 53.8%,有统计学差异(P=0.03);5年总OS分别为87.5%VS 65.4%,有统计学差异(P=0.046)。此外,实验组进展13例患者中,服药6个月组中出现疾病进展10例(76.9%),服药18个月组出现疾病进展3例(23.1%)。两组间有统计学差异(P=0.028)结论:槐耳颗粒能有效提高Ⅲ期三阴性乳腺癌患者5年DFS与OS;2、槐耳多糖抑制三阴性乳腺癌细胞系侵袭迁移能力的初步研究:方法:本研究通过槐耳多糖针对体外乳腺癌4T-1细胞的侵袭迁移的影响及体内小鼠肺转移模型的相关实验对槐耳多糖抑制三阴性乳腺癌细胞系侵袭迁移能力做了初步的探讨。结果:(1)通过Transwell实验发现细胞经槐耳多糖处理后细胞数量明显降低(control组243±21,PS-T处理组52±8,p=0.000);(2)1×10~6 4T1细胞铺满6孔板后用枪头划痕,12h和24h后观察对照组和1μg/ml、5μg/ml槐耳多糖处理组划痕宽度,对照组划痕宽度明显小于实验组;(3)4T-1细胞在小鼠体内的肺转移模型实验中,对于肺转移结节进行评分统计,I级:结节直径<0.5mm;II级:0.5mm≤结节直径<1mm;III级:1mm≤结节直径<2mm;IV级:结节直径≥2mm。转移结节评分计算公式:I×1+II×2+III×3+IV×4。结果显示:对照组小鼠肺表面结节评分为64.7±6.2,显著高于高剂量(13.7±4.1,p=0.008)及低剂量(42.7±5.3,p=0.026)槐耳多糖处理组;(4)利用western检测EMT相关表皮marker:E-cadherin(CDH1)、Occludin(OCLN)和Cytokeratin(CK8);间质marker:N-cadherin(CDH2)、Vimentin和Fibronectin(FN1)的水平。结果发现经槐耳多糖处理后4T-1细胞上皮细胞marker表达显著增加,间质细胞marker表达显著减少。结论:(1)槐耳多糖抑制4T-1细胞侵袭及迁移的能力,并且能够显著抑制4T-1细胞EMT发生;(2)槐耳多糖能够显著抑制乳腺癌高转移性4T-1细胞在小鼠体内的肺转移3、自噬在槐耳多糖抑制三阴性乳腺癌细胞EMT中的作用研究方法:本章节首先利用共聚焦、Western blotting等技术观察PS-T对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞自噬从细胞到蛋白水平的影响进行观察,之后我们通过合成ATG5干扰稳转慢病毒构建了ATG5稳定干扰乳腺癌细胞系,对细胞的侵袭、迁移能力进行观察,并利用Western blotting技术检测自噬在PS-T抑制MDA-MB-231细胞EMT转化中的作用。结果:(1)通过Western blotting实验,结果显示,经过5μg/ml PS-T处理24h后,自噬标志性蛋白LC3-I/II都明显增多,同时P62蛋白减少,Beclin-1蛋白增多,利用LC3-RFP-GFP双色腺病毒感染MDA-MB-231细胞,通过双光子共聚焦显微镜对细胞进行了观察,LC3-GFP和LC3-RFP同时增多,且LC3-RFP数量显著增加;(2)通过westernblotting检测EMT相关表皮marker:E-cadherin、Occludin和Cytokeratin;间质marker:N-cadherin、Vimentin和Fibronectin(FN1)的水平。发现经LY294002处理后,显著抑制了槐耳诱导EMT的表皮marker表达显著增加,间质细胞marker表达显著减少。(3)构建自噬关键蛋白ATG5稳定干扰细胞系。首先设计了靶向ATG5 mRNA 393、443及853位点的三条siRNA,利用qPCR分析了靶向小片段的干扰效率,结果显示靶向853位点的siRNA效率最高,达到70%。将siRNA小片段插入pLVX-Sh RNA2-Puro质粒中,构建慢病毒重组质粒。将构建的质粒命名为pLVX-ShRNA2-Puro-Homo-ATG5-853,将其包装后将转入HEK293细胞中,转染后24h及72h观察其转染效率,测得慢病毒p LVX-ATG5滴度为:8×10~7TU/ml。感染MDA-MB-231,48h后观察其感染效率。随后我们使用筛选出的最佳浓度0.2μg/ml Puromycin对阳性细胞进行筛选。利用有限稀释法获得单克隆细胞,称为MDA-MB-231-siATG5细胞系,然后利用westernblotting及免疫荧光验证ATG5干扰效果。(4)利用Transwell小室实验检测MDA-MB-231-siNC及MDA-MB-231-siATG5迁移能力,结果提示发现细胞经槐耳多糖处理后细胞数量明显降低(siNC组283±21,siNC+PS-T处理组98±8,p=0.015)。siATG5组271±25,siATG5+PS-T处理组238±18,p=0.082。可见siATG5后PS-T对MDA-MB-231迁移的抑制作用明显减弱,p=0.0076,同时划痕实验也验证了该结果。(5)利用transwell侵袭实验检测干扰自噬关键蛋白ATG5后对PS-T抑制MDA-MB-231侵袭能力的影响。结果显示:细胞经槐耳多糖处理后细胞数量明显降低(siNC组37±6,siNC+PS-T处理组14±4,p=0.011)。siATG5组39±9,siATG5+PS-T处理组35±18,p=0.064。可见siATG5后PS-T对MDA-MB-231迁移的抑制作用明显减弱,p=0.0081。(6)western blotting实验观察了ATG5干扰之后,EMT相关蛋白的变化。将细胞经培养基或5μg/ml槐耳多糖处理24h后裂解细胞并收集蛋白,western检测EMT相关表皮marker:E-cadherin(CDH1)、Occludin(OCLN)和Cytokeratin(CK8);间质marker:N-cadherin(CDH2)、Vimentin和Fibronectin(FN1)的水平。结果发现经槐耳多糖处理后MDA-MB-231-siNC细胞上皮细胞marker表达显著增加,间质细胞marker表达显著减少。而干扰ATG5后这一作用被逆转。结论:(1)PS-T显著诱导MDA-MB-231细胞自噬水平上调;(2)抑制自噬能够下调PS-T对MDA-MB-231乳腺癌细胞EMT转化的抑制作用;(3)ATG5干扰后下调了PS-T对MDA-MB-231迁移和侵袭能力的抑制作用;(4)ATG5干扰后下调了PS-T对MDA-MB-231 EMT转化的抑制作用。4、槐耳多糖诱导自噬抑制乳腺癌细胞EMT转化的机制的初步研究:方法:本章节利用Western blotting技术证实EMT转化的关键转录因子Snail在槐耳多糖诱导自噬抑制乳腺癌细胞EMT转化过程中的表达水平。同时利用双荧光素酶实验证实槐耳多糖诱导自噬是通过降解Snail转录因子,从而调节Snail下游的EMT相关蛋白的转录水平。利用免疫荧光实验检测槐耳多糖对MDA-MB-231或MDA-MB-231-siATG5细胞系LC3和Snail蛋白表达水平。最后利用Transwell实验反向验证过表达Snail能够逆转PS-T对乳腺癌细胞侵袭作用的抑制。结果:(1)通过western检测Snail的蛋白水平。结果发现PS-T处理后能够明显减少胞内Snail的蛋白量,但干扰ATG5后,这一作用明显减弱,对Snail几乎无影响;(2)构建了E-cad蛋白启动子报告基因质粒,随后检测了其对PS-T处理的反应,结果显示:与对照组比较,5μg/ml PS-T处理组的荧光比值明显上调,接近5倍,而在干扰ATG5的细胞内这一作用几乎消失(p=0.0008);(3)免疫荧光实验检测槐耳多糖对MDA-MB-231或MDA-MB-231-siATG5细胞系LC3和Snail蛋白表达水平。结果发现PS-T处理后LC3蛋白表达增加,同时能够明显减少胞内Snail的蛋白量,但干扰ATG5后,这一作用明显减弱,对Snail几乎无影响。(4)将MDA-MB-231细胞首先进行pcDNA3.1-snail转染,转染24h后进行transwell实验检测,结果发现细胞经槐耳多糖处理后细胞数量明显降低(Vector组37.3±1.5,Vector+PS-T处理组13.0±1.2,p=0.0001),说明槐耳多糖处理后,细胞侵袭能力降低;过表达snail组54.3±2.8,过表达snail+PS-T处理组49.7±1.5,p=0.2182。可见过表达snail后PS-T对MDA-MB-231迁移的抑制作用明显减弱,p=0.001。结论:槐耳多糖诱导自噬是通过降解Snail转录因子参与抑制乳腺癌细胞EMT转化。