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研究目的:梓醇是传统中药地黄中的主要有效成分,本课题组的前期研究显示,以地黄为君药的中药复方补肾益精方的含药血清对神经元细胞及体外血脑屏障模型均具有显著的保护作用。进一步的体外研究发现,.单味中药地黄的水煎剂具有显著的神经保护功效。故基于前期课题研究结果,本课题拟探究梓醇对纤维状Aβ1-42介导的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)体外模型损伤的影响及潜在的具体机制。研究方法:1.采用噻唑蓝(MTT)法检测bEnd.3细胞活力,探究纤维状Aβ1-42最佳的造模时间及浓度,以及梓醇能够有效发挥最佳的保护作用的浓度;2.采用永生化的小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3和提取的原代星形胶质细胞(astrocytes,As)非接触式共培养BBB模型,通过检测各实验组跨BBB荧光素钠的荧光强度,评价梓醇对该体外模型的通透性的影响;3.采用流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)FITC-V/PI双染法检测梓醇对纤维状Aβ142介导的bEnd.3细胞凋亡情况的影响;4.采用体外单层bEnd.3细胞的BBB模型,探究梓醇对脑内Aβ清除率的影响。5.蛋白免疫印迹法(Westernblot)法检测相关凋亡蛋白、基质金属蛋白酶、连接蛋白及转运蛋白的表达水平,以探究其保护血脑屏障的具体机制。研究结果:1.MTT实验检测结果提示:(1)当采用20μmol·L-1的纤维状Aβ1-42分别损伤24h,48h时,Aβ1-42对bEnd.3细胞活力的抑制率接近50%;(2)50-500 μmol·L-1的梓醇溶液对纤维状Aβ1-42介导bEnd.3细胞活力损伤具有明显抑制作用,可明显提高细胞活力,且其保护作用与梓醇的作用浓度呈正相关性;(3)范围浓度为50-500μmol·L-1的梓醇对bEnd.3细胞本身无明显的毒损作用。2.荧光素钠跨体外血脑屏障模型及Western blot实验结果显示:(1)梓醇可以显著改善纤维状Aβ1-42诱导的血脑屏障高通透性。(2)经梓醇预处理过的bEnd.3细胞可显著抑制纤维状Aβ1-42介导的线粒体和死亡受体凋亡通路相关蛋白的表达水平(Bax,Bcl-2,Cytochromes C,Cleaved Caspase-8,Cleaved Caspase-9,Cleaved Caspasse-3);降低基质金属蛋白酶(matrix metallop-roteinases,MMPs)MMP-2,MMP-9的蛋白水平继而增加内皮细胞之间的紧密连接蛋白ZO-1,Occludin和Claudin-5的蛋白水平。3.此外我们还发现梓醇可增强可溶性Aβ跨体外单层BBB模型的清除率,其机制可能与降低晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE),而增加P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Low-density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP-1)的蛋白水平相关。研究结论:1.梓醇能够显著抑制纤维状Aβ1-42诱导血管内皮细胞bEnd..3的增值能力下降及细胞凋亡情况;2.梓醇能够显著改善纤维状Aβ1-42诱导的体外血脑屏障模型的高通透性,其机制可能是梓醇通过抑制Aβ1-42诱导的脑微血管内皮细胞bEnd.3的凋亡、增加紧密连接蛋白的水平相关。3.梓醇能够提高脑内可溶性Aβ的有效清除率,其机制可能与梓醇能够有效的调节血管内皮细胞上负责转运Aβ的相关转运蛋白相关。