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糖尿病是由多种病因引起的以长期高血糖为特征的一组慢性代谢性疾病。2型糖尿病可能通过多种途径导致骨量减少,骨组织微结构破坏,骨脆性增加,进而引起骨质疏松或骨质疏松性骨折,但目前具体机制尚不完全清楚。在糖尿病患者中,高血糖驱动全身各系统及循环中晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end-products,AGEs）的加速形成和沉积,可显著抑制成骨细胞的增殖,增加破骨细胞的活性,最终导致骨质疏松性骨折。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）具有自我更新和多向分化潜能,与骨质疏松症性骨折密切相关。越来越多的证据表明,长链非编码RNA（long noncoding RNAs,lnc RNAs）参与调控骨髓间充质干细胞的焦亡。本研究基础部分旨在探讨lnc RNA ORLNC1（NOMMUT016106.2）在CML（最常见的AGEs）刺激下对骨髓间充质干细胞焦亡的作用及其特定的分子机制,临床部分旨在探讨2型糖尿病患者骨折风险相关因素分析,为2型糖尿病与骨折风险之间关系研究提供新的理论依据和临床证据。具体分为以下三个部分:第一部分Lnc RNA ORLNC1在骨髓间充质干细胞焦亡中的生物学效应研究目的:探讨Lnc RNA ORLNC1在骨髓间充质干细胞焦亡中的作用方法:1.分离和培养小鼠骨髓间充质干细胞,并通过流式细胞仪、成脂和成骨分化试验对其进行鉴定。2.BMSCs经CML处理后进行TUNEL检测,验证CML处理对焦亡的影响。用RT-q PCR和Western blot检测BMSCs焦亡相关基因（NLRP3和Caspase1）的表达水平,并用免疫荧光法验证。3.通过pc DNA3.1（Pc ORLNC1）和si RNA（si-ORLNC1）改变ORLNC1在BMSCs中的表达,然后联合CML处理,探讨CML和ORLNC1对BMSCs焦亡的影响。结果:1.镜下可见小鼠BMSCs呈成纤维细胞样,可见颗粒和空泡。流式细胞仪检测发现BMSCs表达CD73（+）、CD90.2（+）、CD11b（-）、CD34（-）。诱导成骨分化后,钙化结节用茜素红染料染色为红色,诱导成脂分化后,球状油脂用油红O染料染色为红色。2.TUNEL检测结果显示CML处理引起BMSCs焦亡。RT-q PCR和Western blot检测结果提示CML处理上调了NLRP3炎症小体和焦亡相关基因cl-Caspase1的表达水平,免疫荧光分析也显示CML处理显著上调了NLRP3和Caspase1的水平。3.Pc ORLNC1组ORLNC1的表达显著提高。经过CML处理的BMSCs中ORLNC1的表达亦提高但低于Pc ORLNC1组。联合CML处理和si RNA后的ORLNC1表达量明显低于单独CML处理后的ORLNC1表达量。Western blot和免疫荧光分析检测结果均提示CML上调ORLNC1的表达从而促进了BMSCs的焦亡,CML处理联合敲除ORLNC1后显著下调了焦亡相关蛋白的表达。小结:CML通过上调ORLNC1的表达从而促进骨髓间充质干细胞的焦亡。第二部分Lnc RNA ORLNC1在骨髓间充质干细胞焦亡中的作用机制研究目的:探讨Lnc RNA ORLNC1在BMSCs焦亡中的作用机制。方法:1.预测mi R-200b-3p与Lnc RNA ORLNC1的结合位点,用双荧光素酶报告实验验证。用CML处理以得到Lnc RNA ORLNC1的高表达,用RIP-Pull-down、PCR和Western blot检测Lnc RNA ORLNC1与mi R-200b-3p通过Ago2的直接结合。用RT-q PCR方法检测Lnc RNA ORLNC1和mi R-200b-3p表达改变后mi R-200b-3p的表达水平,用TUNEL法检测BMSCs的焦亡。Western blot检测焦亡相关基因蛋白表达水平,并用免疫荧光法验证。2.预测foxo3与mi R-200b-3p的结合位点,用双荧光素酶报告实验验证。改变mi R-200b-3p和Foxo3表达后用Western blot检测Foxo3蛋白表达水平,用TUNEL法检测BMSCs的焦亡。Western blot检测NLRP3和Caspase1的蛋白表达水平,并用免疫荧光法验证。3.根据CML处理后有关Lnc RNA ORLNC1的表达及ORLNC1敲除后mi R-200b-3p及Foxo3蛋白的表达,设立NC组、CML组、CML+si-ORLNC1组、CML+mi R-Mimic组和CML+si-Foxo3共5组。通过RT-q PCR和Western blot检测了Lnc RNA ORLNC1、mi R-200b-3p和Foxo3在5组中的表达情况。TUNEL实验、Western blot和免疫荧光分析验证其作用。4.体内实验验证。经CML处理后的小鼠,用RT-q PCR和Western blot检测骨髓间充质干细胞NLRP3炎症小体和焦亡相关基因Caspase1的相对m RNA和蛋白表达,比较CML处理组与NC组的m RNA和蛋白表达水平。结果:1.mi R-200b-3p模拟物显著抑制ORLNC1-WT的荧光素酶活性,mi R-200b-3p抑制剂显著促进ORLNC1-WT的荧光素酶活性,而当可能的结合位点发生突变时,这种抑制/促进作用都被取消。IP、Western blot和PCR实验证实ORLNC1与mi R-200b-3p通过Ago2直接结合。RT-q PCR结果示ORLNC1过表达组mi R-200b-3p表达减少,ORLNC1敲低组mi R-200b-3p表达增加。TUNEL染色结果显示,ORLNC1的高表达促进了细胞的焦亡,而mi R-200b-3p的同时高表达减轻了ORLNC1诱导的焦亡程度。Western blot和免疫荧光分析检测也证实ORLNC1的高表达促进了NLRP3和Caspase1的表达,而mi R-200b-3p的同时高表达减轻了NLRP3和Caspase1的表达;反之,ORLNC1的敲低抑制了NLRP3和Caspase1的表达,而mi R-200b-3p的同时敲低则增加了NLRP3和Caspase1的表达。2.在Foxo3-WT组中,mi R-200b-3p高表达组的荧光强度明显低于mi R-200b-3p低表达组。而在foxo3-mut组,mi R-200b-3p的表达对荧光强度无明显影响。Western blot结果显示mi R-200b-3p与Foxo3的表达呈显著负相关。TUNEL染色结果显示,mi R-200b-3p的高表达抑制了细胞的焦亡,同时Foxo3的高表达促进了细胞的焦亡。相反,单独敲除mi R-200b-3p促进了焦亡,而伴随着Foxo3的低表达减轻了焦亡。用Western blotting和免疫荧光检测也证实mi R-200b-3p的高表达抑制了NLRP3和Caspase1的表达,同时Foxo3的高表达促进NLRP3和Caspase1的表达。相反,单独敲低mi R-200b-3p会促进NLRP3和Caspase1的表达,而伴随Foxo3低表达会降低NLRP3和Caspase1的表达。3.RT-q PCR和Western blot检测结果表明ORLNC1是mi R-200b-3p的ce RNA,下调ORLNC1或上调mi R-200b-3p均降低Foxo3的表达。下调ORLNC1或上调mi R-200b-3p或下调Foxo3均可减轻CML诱导的BMSCs焦亡。Western blot和免疫荧光分析也证实对CML处理的BMSCs,下调ORLNC1或上调mi R-200b-3p或下调Foxo3均可减轻NLRP3和Caspase1的表达水平。4.在体内动物实验中,CML处理的小鼠的骨髓间充质干细胞被明显破坏。与NC组相比,CML治疗组小鼠的ORLNC1和Foxo3水平较高,mi R-200b-3p水平较低。CML处理小鼠的BMSCs中cl-Caspase1和NLRP3的表达显著上调。小结:1.Lnc RNA ORLNC1 是mi R-200b-3p的ce RNA。2.foxo3是mi R-200b-3p的靶基因。3.lnc RNA ORLNC1通过靶向mi R-200b-3p/Foxo3途径促进了CML诱导的骨髓间充质干细胞焦亡。第三部分2型糖尿病患者骨折风险相关因素分析目的:本研究旨在探讨2型糖尿病患者糖尿病相关因素与FRAX评分的相关性,为2型糖尿病与骨折风险之间关系研究提供一定临床试验依据。方法:选取2021年1月-2021年12月石家庄市第二医院内分泌科门诊及住院2型糖尿病患者117例,其中男性52例,女性65例,年龄40-80岁。分别记录患者年龄、性别、BMI、骨折史、父母髋骨骨折史、目前吸烟状况、饮酒状况、肾上腺皮质激素用药史、风湿性关节炎病史、其他继发性骨质疏松症病史、使用双膦酸盐类、降钙素、PTH类似物等治疗骨质疏松药物史;抽取患者空腹静脉血、留取随机尿样,采用全自动生化分析仪测定空腹血糖（Fasting plasma glucose,FPG）、糖化血红蛋白（Hb Alc）、各项血脂指标及尿微量白蛋白/肌酐（UACR）;应用双能X线骨密度仪检测所有患者左侧股骨颈骨密度;应用FRAX测评系统评估患者主要骨质疏松性骨折（MOF）及髋部骨折（HF）未来10年发生概率。使用SPSS21.0进行统计分析。结果:1.2型糖尿病患者MOF评分与年龄、FBG、Hb A1c、UACR水平呈正相关,与TC、TG、HDL-C、LDL-C、空腹胰岛素、空腹C肽水平无直线相关性关系;2型糖尿病患者HF评分与年龄、FBG、Hb A1c、UACR水平呈正相关,而与TC、TG、HDL-C、LDL-C、空腹胰岛素、空腹C肽水平无直线相关性关系。2.FBG与FRAX评分MOF呈正相关。多重线性回归分析结果显示:模型一:以FRAX评分MOF为因变量,以FBG为自变量,未调整其他变量,FBG与MOF呈正相关。模型二:以FRAX评分MOF为因变量,以FBG、UACR为自变量,FBG与MOF呈正相关。3.FBG与FRAX评分HF呈正相关。多重线性回归分析结果显示:模型一:以FRAX评分HF为因变量,以FBG为自变量,未调整其他变量,FBG与HF呈正相关。模型二:以FRAX评分HF为因变量,以FBG、UACR为自变量,FBG与HF呈正相关。4.Hb A1c与FRAX评分MOF呈正相关。多重线性回归分析结果显示:模型一:以FRAX评分MOF为因变量,以Hb A1c为自变量,未调整其他变量,Hb A1c与MOF呈正相关。模型二:以FRAX评分MOF为因变量,以Hb A1c、UACR为自变量,Hb A1c与MOF呈正相关。5.Hb A1c与FRAX评分HF呈正相关。多重线性回归分析结果显示:模型一:以FRAX评分HF为因变量,以Hb A1c为自变量,未调整其他变量,Hb A1c与HF呈正相关。模型二:以FRAX评分HF为因变量,以Hb A1c、UACR为自变量,Hb A1c与HF呈正相关。小结:1.2型糖尿病患者增龄、FBG及Hb A1c升高、UACR水平升高与主要骨质疏松性骨折和髋部骨折风险增加相关。2.2型糖尿病患者血糖水平与FRAX评分呈正相关。3.2型糖尿病患者FBG与Hb A1c升高提示骨折风险增加。结论:1.CML通过上调ORLNC1的表达从而促进骨髓间充质干细胞的焦亡。2.lnc RNA ORLNC1通过靶向mi R-200b-3p/Foxo3途径促进了CML诱导的骨髓间充质干细胞焦亡。3.2型糖尿病患者血糖水平与骨折风险呈正相关。血糖水平升高提示骨折风险增加。