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目的:应用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞胰岛素样生长因子1型受体(type I insulin-like growth factor receptor,IGF-1R)的表达,探讨IGF-1R在乳腺癌细胞体外增殖、迁移及在乳腺癌移植瘤生长中所起的作用,并探讨IGF-1R调控乳腺癌增殖和迁移的信号转导通路。
方法:构建携带有绿色荧光蛋白报告基因的IGF-1R shRNA质粒载体,高效转染293T细胞,通过RT-PCR和Western blot技术分别检测IGF-1R mRNA和蛋白表达水平,筛选沉默效率最高的shRNA表达质粒。通过脂质体法将该质粒转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,倒置荧光显微镜下观察转染效率,CCK-8法检测细胞增殖能力,体外迁移实验检测细胞迁移能力。通过G418筛选IGF-1R基因沉默的细胞稳株,接种于重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency ,SCID)小鼠乳腺脂肪垫成瘤,同时设立对照组,定期观察肿瘤生长情况。使用小分子抑制物LY294002和PD98059分别抑制磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)通路和有丝分裂活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的信号转导,并给予胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)刺激,检测乳腺癌细胞体外增殖和迁移能力的变化。
结果:成功构建IGF-1R shRNA质粒载体,并筛选出沉默效率最高的shRNA表达质粒。该质粒转染293T细胞后,IGF-1R mRNA和蛋白表达水平明显下降。该质粒转染MDA-MB-231细胞的效率约为60%。使用G418筛选和有限稀释法获得稳转细胞株,其体外增殖和迁移能力受到显著抑制(p<0.01)。成功构建SCID小鼠乳腺癌移植瘤模型,IGF-1R基因沉默组的肿瘤生长明显减慢,移植瘤的体积明显小于对照组(p<0.01)。IGF-1干预后MDA-MB-231细胞增殖和迁移能力明显增强(p<0.05),LY294002和PD98059对IGF-1干预下的细胞增殖和迁移均有显著抑制作用(p<0.01)。
结论:IGF-1R shRNA表达质粒能够显著抑制MDA-MB-231细胞IGF-1R的表达,显著抑制乳腺癌细胞的体外增殖和迁移能力。IGF-1R基因沉默的乳腺癌细胞在SCID小鼠内的增殖能力明显降低。IGF-1促进乳腺癌细胞增殖和迁移的作用与PI3K通路、MAPK通路相关。