论文部分内容阅读
子宫内膜癌（endometrial carcinoma,EC）是全世界女性最常罹患的三大妇科癌肿之一。根据雌激素参与发病与否及其生物学特性,可将子宫内膜癌分类为I型和II型,前者为雌激素依赖型,以子宫内膜样腺癌为代表;后者为非雌激素依赖型或称特殊病理类型。虽然子宫内膜癌依此分类表现在组织学分化、手术-病理分期、侵润程度和雌激素受体状态等方面存有较大差异,但是许多研究已经证实,I型和II型子宫内膜癌发生发展过程中可能存在着殊途同归的共同步骤:即特异性抗细胞凋亡同时促细胞增殖的基因或蛋白异常表达上调,会致使子宫内膜细胞生长调控逃逸现象发生。因此,深入探究该类特异性过表达基因/蛋白及其调控机制,不仅有利于深层次揭示子宫内膜癌的发生、发展机制,同时还将为其临床精准治疗发掘新的靶点和方向。DJ-l蛋白是一种新型丝裂原依赖性癌基因产物,最早由日本学者在1997年发现,该蛋白在不同物种中高度保守,在超过22种人体组织中普遍表达,以二聚体形态参与各种细胞生命活动,如转录调控、氧化应激反应、受精、线粒体调控、炎症纤维化形成、糖基化损伤预防、促细胞生长增殖、抑制细胞凋亡及“分子伴侣”等。随着近年来不断深入的研究,愈来愈多证据显示在多种恶性肿瘤的发生发展中DJ-1均有参与,并可能发挥了关键作用。最近,我们科研团队前期研究表明,DJ-1在子宫内膜癌细胞中呈过表达,并可通过促细胞生长增殖和抗细胞凋亡,进而有利于子宫内膜癌的发生发展。然而,调控DJ-1在子宫内膜癌细胞中表达上调的分子机制仍需进一步揭示。目前,大量研究表明,启动子区DNA甲基化介导的miRNAs沉默是导致其所调控的肿瘤相关靶基因表达上调的重要机制之一。因此,我们推测子宫内膜癌中DJ-1表达上调很可能也是靶向调控DJ-1的miRNA分子因其基因启动子区的CpG岛发生高DNA甲基化表观遗传调控所致。于是,我们前期采用micro RNA.org、Pic Tar、Target Scan Human 7.0及Cometa等四种生物信息学分析工具预测可能靶向调控DJ-1表达的miRNA分子,并利用CpG岛在线预测软件对所预测的miRNA进行检索,结果发现miR-128-2是4种miRNA分析工具均预测得到的,并且其基因启动子区存在丰富CpG岛的miRNA分子。随后,通过荧光实时定量PCR测定发现,较之正常子宫内膜组织,子宫内膜癌组织中的miR-128-2表达显著降低。与此同时,通过文献调研我们也有趣地发现miR-128-2基因启动子区被报道确实存在DNA甲基化修饰,并且作为肿瘤抑制因子参与调控了多种肿瘤细胞的增殖。此外,值得关注的是,有学者最近在肝癌细胞中发现miR-128-2表达下降,而DJ-1表达上升;且过表达的miR-128-2可显著下调DJ-1蛋白的表达,并引发多激酶抑制剂Sorafenib所诱导的肝细胞凋亡,表明DJ-1表达过程中miR-128-2可能是关键的调控因子。显然,上述证据强烈地提示着子宫内膜癌细胞中DNA甲基化表观遗传调控的miR-128-2表达缺失很可能与DJ-1表达上调密切相关。但在子宫内膜癌细胞中DNA甲基化是否通过直接下调miR-128-2的表达,进而靶向调控DJ-1的表达有待于从多水平、多角度进一步明确。鉴于此,本研究拟首先在子宫内膜癌组织水平寻找到DJ-1上调表达与miR-128-2基因启动子DNA甲基化状态相关的证据。其次,在子宫内膜癌细胞系水平,采取一系列分子生物学手段进一步明确子宫内膜癌细胞中miR-128-2基因启动子区高DNA甲基化介导miR-128-2表达沉默是否会导致上调DJ-1表达。随后,观察DJ-1表达经miR-128-2基因启动子区DNA甲基化调控后,能否对子宫内膜癌细胞的生物学行为产生实质性影响（如增殖、凋亡、迁移及侵袭等）。本研究的完成有利于进一步揭示子宫内膜癌发生发展中DJ-1的作用及其表达的分子调控机制,同时也为子宫内膜癌临床精准治疗发掘新的靶点和方向。第一部分 子宫内膜癌组织中miR-128-2基因启动子DNA甲基化水平与miR-128-2、DJ-1表达以及临床病理因素相关性的研究目的:检测新鲜子宫内膜癌组织以及癌旁正常组织中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化水平以及miR-128-2和DJ-1表达水平;同时分析它们之间的相关性,拟从组织学水平寻找miR-128-2基因启动子DNA甲基化可能参与子宫内膜癌DJ-1表达调控的相关证据。方法:收集南昌大学附属妇幼保健院63例子宫内膜癌病例经手术切除的癌组织标本及其相配对的癌旁正常子宫内膜组织,运用荧光实时定量甲基化特异性PCR（qMSP）方法测定组织中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化程度、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法测定组织中miR-128-2以及DJ-1 mRNA表达丰度、蛋白免疫印迹（Western-Blot,WB）方法检测DJ-1蛋白表达的水平,同时比较分析miR-128-2基因启动子DNA甲基化与miR-128-2、DJ-1表达以及临床病理因素间的相关性。结果:与癌旁正常子宫内膜组织相比较,子宫内膜癌组织中miR-128-2启动子区DNA甲基化水平显著增加（P＜0.01）,同时miR-128-2表达下调而DJ-1 mRNA及蛋白表达上调（P＜0.01）;通过相关性分析发现子宫内膜癌组织中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化程度与miR-128-2表达负相关（Pearson相关系数r=-0.9693,P＜0.01）而与DJ-1 mRNA表达正相关（Pearson相关系数r=0.8762,P＜0.01）。此外,通过临床病理资料发现miR-128-2甲基化水平、miR-128-2以及DJ-1 mRNA表达水平均与子宫内膜癌患者的病理学分型、组织学分化无关,而与子宫内膜癌患者的肿瘤侵润深度、淋巴结转移及手术-病理分期有关（P＜0.05）。结论:在组织水平佐证了子宫内膜癌中DJ-1表达上调可能与miR-128-2基因启动子区高DNA甲基化及其表达沉默有关。第二部分 DNA甲基化介导miR-128-2沉默对子宫内膜癌细胞中DJ-1表达的影响目的:在子宫内膜癌细胞系水平,进一步明确miR-128-2基因启动子DNA甲基化致miR-128-2表达沉默是上调子宫内膜癌细胞内DJ-1表达的重要调控机制。方法:1.利用正常人子宫内膜上皮细胞（ESC）和4种子宫内膜癌细胞株（Ishikawa、RL95-2、KLE为分化程度不同的I型子宫内膜癌细胞株,SPEC-2为II型子宫内膜癌细胞株）,采用qMSP方法检测细胞中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化的水平,采用qRT-PCR测定miR-128-2及DJ-1 mRNA表达水平,WB检测DJ-1蛋白表达水平,比较分析它们在不同的子宫内膜癌细胞系中的差异变化及相关性。2.将miR-128-2 mimic和miR-128-2 inhibitor依次分别转染Ishikawa和SPEC-2子宫内膜癌细胞株,并设立相应的阴性对照,采用qRT-PCR测定细胞中miR-128-2及DJ-1 mRNA表达水平的变化,WB检测DJ-1蛋白表达水平的变化,以求阐明miR-128-2是否能调控内源性DJ-1表达。3.分别构建含野生型DJ-1-3’UTR的重组荧光素酶报告载体pGL3-DJ-1-3’UTR-wt和含有突变型DJ-1-3’UTR的重组荧光素酶报告载体pGL3-DJ-1-3’UTR-mut,与miR-128-2 mimic或它的阴性对照mimic-NC共转染Ishikawa和SPEC-2子宫内膜癌细胞后,采用双荧光素酶报告基因系统试剂盒测试荧光素酶的活性变化,验证DJ-1是否为miR-128-2直接靶基因。4.Ishikawa和SPEC-2子宫内膜癌细胞经5μM甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-d C）药物预处理48 h或5-Aza-d C预处理后再转染miR-128-2 inhibitor48 h,随后,qMSP检测miR-128-2基因启动子DNA甲基化水平的变化、qRT-PCR检测miR-128-2和DJ-1 mRNA表达丰度的变化、WB检测DJ-1蛋白的表达水平变化,以求阐明子宫内膜癌细胞中miR-128-2基因启动子DNA甲基化是否沉默miR-128-2表达进而上调DJ-1表达。结果:1.与正常人子宫内膜上皮细胞ESC相比较,Ishikawa、RL95-2、KLE及SPEC-2四种子宫内膜癌细胞中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化水平均显著增加（P＜0.01）,同时miR-128-2表达明显下调（P＜0.01）,而DJ-1 mRNA及蛋白表达显著增加（P＜0.01）;通过相关性分析发现miR-128-2甲基化水平与miR-128-2表达具有显著负相关性（Pearson相关系数r=-0.9124,P＜0.01）而与DJ-1 mRNA表达具有显著正相关性（Pearson相关系数r=0.8304,P＜0.01）;此外,miR-128-2表达与DJ-1 mRNA的表达表现为负相关性（Pearson相关系数r=-0.8963,P＜0.01）。2.Ishikawa和SPEC-2细胞中转染miR-128-2 inhibitor后,DJ-1 mRNA及蛋白表达水平较对照组均有明显升高（P＜0.01）,而miR-128-2 mimic转染细胞后,较之对照组,DJ-1 mRNA及蛋白表达水平均出现明显下降（P＜0.01）。3.miR-128-2 mimic转染细胞后,重组报告质粒pGL3-DJ-1-3’UTR-wt（野生型）的荧光素酶活性大幅降低（P＜0.01）,但miR-128-2 mimic对重组报告质粒pGL3-DJ-1-3’UTR-mut（突变型）的荧光素酶活性却无法产生作用（P＞0.05）,提示miR-128-2可直接与DJ-1 3’UTR靶向结合。4.经5μM甲基化抑制剂5-Aza-d C预处理48 h后,Ishikawa及SPEC-2细胞中miR-128-2甲基化水平均显著下降（P＜0.01）,miR-128-2表达均显著上升（P＜0.01）,而DJ-1 mRNA和蛋白表达水平均显著下降（P＜0.01）。此外,5-Aza-d C预处理上调miR-128-2表达并下调DJ-1 mRNA和蛋白表达的作用可被miR-128-2inhibitor所逆转（P＜0.01）,然而,5-Aza-d C预处理下降miR-128-2甲基化水平的作用却未能被miR-128-2 inhibitor影响。结论:子宫内膜癌细胞中DJ-1的表达可由miR-128-2直接靶向负调控;miR-128-2基因启动子区DNA甲基化致miR-128-2表达沉默是调控子宫内膜癌细胞中上调DJ-1表达的关键机制。第三部分 miR-128-2甲基化调控DJ-1表达影响子宫内膜癌细胞的生物学行为目的:观察miR-128-2基因启动子区DNA甲基化沉默miR-128-2表达进而上调DJ-1表达后,能否对子宫内膜癌细胞的生物学行为产生进一步影响（如增殖、凋亡、迁移及侵袭等）。方法:借助甲基化抑制剂5-Aza-d C、miR-128-2抑制剂（inhibitor）及DJ-1过表达慢病毒载体LV-DJ-1,进一步检测Ishikawa和SPEC-2子宫内膜癌细胞经5-Aza-d C药物预处理后或5-Aza-d C与miR-128-2 inhibitor或LV-DJ-1共处理后以下指标的变化情况,明确miR-128-2基因启动子DNA甲基化沉默其表达进而上调DJ-1表达后,是否会对子宫内膜癌细胞的生物学行为产生实质性影响:（1）细胞增殖变化采用CCK-8实验测定;（2）细胞凋亡变化情况采用流式细胞术检测;（3）细胞迁移、侵袭能力变化采用Transwell小室法实验检测。结果:Ishikawa及SPEC-2子宫内膜癌细胞经5μM甲基化抑制剂5-Aza-d C预处理48 h后,细胞增殖明显减弱（P＜0.01）,同时细胞凋亡率显著增加（P＜0.01）,而细胞迁移和侵袭能力明显降低（P＜0.01）。重要的是,miR-128-2 inhibitor和LV-DJ-1转染可逆转5-Aza-d C预处理所致生物学功能下调的效应（P＜0.01）。结论:miR-128-2甲基化致其表达沉默进而上调子宫内膜癌细胞DJ-1表达后,可阻遏子宫内膜癌细胞凋亡,并促进子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁徙。