论文部分内容阅读
第一部分构建shRNA真核表达载体抑制人COX-2表达目的：构建编码人COX-2 mRNA的shRNA真核表达载体质粒，特异性抑制人COX-2的表达。方法：以人COX-2 mRNA编码区中两条不同序列作为RNA干扰靶点，分别构建两个shRNA真核表达载体质粒，WBH1和WBH2，进行酶切鉴定和测序。用脂质体转染人胃癌细胞系SGC7901，RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。结果：WBH1高效特异地抑制了人COX-2的表达，抑制率达70.42％。而WBH2未产生抑制效果。结论：通过构建COX-2的shRNA真核表达载体导入细胞中后可以有效地抑制人胃癌细胞中COX-2的表达，其抑制效果与靶点的选择高度相关。第二部分COX-2表达抑制后对人胃癌细胞系SGC-7901增殖和凋亡的影响目的：了解COX-2表达与肿瘤细胞增殖和凋亡的关系，从而明确是否COX-2可以作为肿瘤治疗的靶点。探讨利用RNA干扰技术作为肿瘤基因治疗的方法。方法：分别采用MTT法和流式细胞仪检测COX-2表达被抑制后细胞的增殖和凋亡情况。15只裸鼠随机分为3组，每组5只，皮下接种胃癌细胞。抑制组：接种转染抑制质粒的胃癌细胞；正常对照组：接种未转染的胃癌细胞；阴性对照组：接种转染阴性对照质粒的胃癌细胞。4周后观察比较各组裸鼠皮下形成瘤体的大体和病理情况并计算抑瘤率。结果：COX-2表达被抑制后，细胞增殖受到明显抑制(p=0.002)，细胞凋亡率明显增高，与未转染和转染阴性对照质粒的胃癌细胞的凋亡率相比有极显著性差异(52.28％±17.91％vs0.52％±0.27％vs0.54％±0.16％，p=0.009)。正常对照组和阴性对照组所有裸鼠均有瘤体形成，平均瘤重分别为0.49±0.017克和0.49±0.013克。抑制组仅2只有瘤体形成平均瘤重0.05±0.003克，与正常对照组相比有显著性差别(p＜0.01)，抑瘤率为89.8％。结论：COX-2与肿瘤细胞的增殖和凋亡密切相关，抑制细胞中COX-2的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡。第三部分电穿孔法介导环氧合酶-2基因沉默抑制裸鼠移植瘤的研究目的：在体研究COX-2基因沉默对人胃癌细胞系SGC-7901裸鼠皮下生长的影响，验证COX-2是否可作为利用RNA干扰进行基因治疗的靶点。方法：制作人胃癌细胞系SGC-7901裸鼠皮下移植瘤模型(n=15)，治疗组和阴性对照组分别于瘤体内注射WBH1和阴性对照质粒，空白对照组瘤体内注射等体积PBS。行在体电穿孔转导。一周后比较各组瘤体的平均瘤重、大体和病理情况，并计算抑瘤率。数据行单因素多组间检验和t检验。结果：治疗组瘤体平均重量(0.300±0.056克)明显小于阴性对照组(0.523±0.029克)和空白对照组(0.554±0.058克)，p＜0.01。抑瘤率为45.84％。阴性对照组与空白对照组平均瘤重无显著性差别，p=0.585。光镜下各组瘤组织病理切片未见明显区别。结论：抑制COX-2的表达可以抑制肿瘤的生长，COX-2可以作为利用RNA干扰技术进行相关肿瘤基因治疗的靶点。