论文部分内容阅读
柑橘褐斑病是柑橘上的重要病害,可引起大量落叶、落果、枯梢等严重问题。柑橘褐斑病菌可分泌一种寄主专化性毒素(Host Selective Toxins,HSTs)-ACT毒素,只专化性为害特定基因型的橘、葡萄柚、杂交橘橙或橘柚。病菌分生孢子在萌发时即可产生ACT毒素,这些毒素进入细胞后破坏其质膜系统,引起电解质渗漏和细胞死亡,然后从死亡的寄主细胞获取营养而生长。目前对柑橘褐斑病的病原种类尚有争议,为了解决这个问题,本研究对来自我国不同地区、不同柑橘品种上分离的78个链格孢菌株进行了全基因组测序和比较分析。转录因子又称为反式作用元件,其DNA结合域能与特定的靶基因上游启动子区域的顺式作用元件产生特异性结合,从而调控靶基因时空表达,调控生命活动。碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)是真核生物特有的DNA结合域氨基端富含碱性氨基酸,羧基端含有亮氨酸拉链的转录因子家族。虽然bZIP转录因子家族基因在一些真菌有所报道,但在链格孢属真菌尚无系统研究。本研究首先通过生物信息学分析方法鉴定了柑橘褐斑病菌Z7菌株中的所有bZIP转录因子,利用同源重组技术敲除其中13个bZIP转录因子基因,并进行了初步的表型分析,在此基础上详细分析了 bZIP21(AaMetR)基因的生物学功能,并比较了 AaMetR缺失突变体和野生型Z7转录组,预测了 AaMetR调控真菌甲硫氨酸代谢途径的靶基因并敲除验证,初步阐明了 AaMetR调控真菌甲硫氨酸合成机理。现将研究结果总结如下:一、柑橘相关的链格孢菌比较基因组分析本研究对柑橘叶片上分离的67株对柑橘叶片有致病性、10株对柑橘叶片无致病性、5株致病性尚不确定的链孢菌基因组进行比较分析,结果显示其基因组大小为33036879bp～34687595bp,scaffolds 数量为 111～443 个,GC 含量为 50.87%～51.31%,共编码12159～12585个基因、130～142个tRNA基因、11～15个rRNA基因、25～37个次级代谢物基因簇。次级代谢物基因簇主要包括非核糖体肽合酶(nrps)、聚酮合酶Ⅰ(tlpks)、聚酮合酶Ⅱ(t2pks)、聚酮合酶Ⅲ(t3pks)、萜烯(terpenes)、羊毛硫多肽(lanthipeptide)、脂肪酸(fatty acid)等,其中,非核糖体肽合酶(nrps)和聚酮合酶Ⅰ(tlpks)在致病菌株中的数量明显高于非致病菌株,暗示这两类基因簇可能与链格孢菌的致病性有关。我们还发现致病菌株的基因组大小和编码基因数量都显著高于非致病菌株,原因可能是致病菌株多一条携带多拷贝ACT毒素基因簇的非必需染色体(conditionally dispensable chromosome,CDC)。本研究首次将Z7基因组拼接成接近染色体水平,包括10条核心染色体和一条非必需染色体(CDC)。全基因组比较分析发现柑橘褐斑病菌至少包括3个完全不同种类的链格孢菌:A.alterna、A.gaisen和A.tangelonis。碳水化合物酶(CAZymes)分析表明柑橘上分离的链格孢菌包含了 290～299个糖苷水解酶(GHs),110～116个糖基转移酶(GTs),24～26个多糖裂解酶(PLs),168～181个碳水化合物酯酶(CEs),152～160个辅酶(AAs)和67～76个碳水化合物结合模块酶类(CBM)。由于这些碳水化合物酶的种类和数量在柑橘褐斑病菌株与非致病型链格孢菌中无显著差异,因此推测碳水化合物酶与柑橘褐斑病菌的致病性无关联性。二、柑橘褐斑病菌bZIP转录因子的鉴定和功能分析本课题利用HMMER3.0软件,通过bZIP保守域全蛋白序列鉴定了柑橘褐斑病菌所有bZIP转录因子,利用同源重组技术敲除了其中13个bZIP转录因子,比较分析突变体和野生型菌株的表型发现:(1)在营养生长方面,突变体△bZIP17(7(Atf1)、△bZIP22和△bZIP24生长速率减慢;突变体△bZIP19(Hac1)和△bZIP21(MetR)气生菌丝减少;突变体△bZIP14菌丝在MM培养基生长稀疏。(2)在分生孢子的产生方面,突变体△AaMetR不产孢;突变体△bZIP24产孢量下降。(3)在致病性方面,突变体△bZIP23(AaAP1)致病力下降;突变体△AaMetR致病性丧失。(4)在真菌抗氧化胁迫方面,突变体△AaAP和和△AaMetR对氧化胁迫的敏感性增加。(5)突变体△AaMetR为甲硫氨酸营养缺陷型,AaMetR对链格孢的营养生长、致病、产孢、黑色素形成、抗氧化胁迫及气生菌丝形成等诸多生物学功能有重要的影响,并由此推测甲硫氨酸是柑橘褐斑病菌维持正常生理活动的重要保障。三、AaMetR调控甲硫氨酸代谢机制研究通过柑橘褐斑病菌野生型和△AaMetR的转录组测序,发现956个基因在突变体△AaMetR上调,1086个基因在△AaMetR下调。KEGG PATHWAY分析表明,共有798个差异表达基因(DEGs)定位于KEGG途径,包括13个DEGs定位在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径,有趣的是,其中12个DEGs在△AaMetR上调。本研究敲除了半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径上调的5个DEGs,包括AaMetB、AaMetC、AaMetE、AaMsrC和AaMetX,发现突变体△AaMetE、△AaMsrC与野生型无差异;突变体△AaMetB、△AaMetC和△AaMetX为甲硫氨酸营养缺陷型和高半胱氨酸营养缺陷型,但不是半胱氨酸营养缺陷型;而AAaMetR不仅是甲硫氨酸和高半胱氨酸营养缺陷型,还是半胱氨酸营养缺陷型。AaMetC是真菌甲硫氨酸合成A途径的关键基因,催化胱硫醚合成高半胱胺酸;AaMetB和AaMetX是真菌甲硫氨酸合成B途径的关键基因,AaMetB催化O-乙酰高丝氨酸合成高半胱胺酸或胱硫醚,AaMetX催化高半胱胺酸合成O-乙酰高丝氨酸。有趣的是,突变体△AaMetB、△AaMetC和△AaMetX对氧化胁迫不敏感,△AaMetR对氧化胁迫敏感,表明AaMetR是调控真菌甲硫氨酸合成的关键调控因子,在还可能影响柑橘褐斑病菌对氧化胁迫的抵抗反应。