论文部分内容阅读
樟叶越桔(Vaccinium dunalianum Wight)属杜鹃花科越桔属植物。主产于云南、贵州、四川、西藏等地,在云南省境内则主要分布于云南西北部经滇中高原至滇南和滇东南。其幼嫩叶芽,因形似雀嘴呈锥状,在云南彝族民间又称“雀嘴茶”,据记载自明代开始就作为一种茶代用品长期饮用至今,具有祛风除湿、舒筋活络等功效。樟叶越桔还是一种富含咖啡酰熊果苷类物质的特殊资源植物,其主要成分的黑色素生成抑制活性优于熊果苷,且毒性仅为熊果苷的1/2。熊果苷是源于绿色植物的天然活性物质,是国际公认的21世纪的最为安全有效的理想皮肤美白祛斑活性剂。由于熊果苷作为次生代谢产物通常以微量形式存在于植物体中,且天然植物来源困难,因此,樟叶越桔有望作为熊果苷天然替代品资源加以应用,具有重要的开发价值。本研究以樟叶越桔为植物材料,分别开展了樟叶越桔根部内生真菌及内生细菌的分离鉴定及多样性分析、优势内生真菌二型伞霉的抗旱促生作用等生物学特性以及二型伞霉次生代谢产物的化学成分分离鉴定等三方面的研究工作,以期为深入研究内生菌与宿主植物抗性、次生代谢产物之间的关系奠定科学基础,以及为樟叶越桔及其内生菌资源的进一步综合开发利用提供科学依据。取得的主要研究结果如下:1.从樟叶越桔根部分离培养了284株内生真菌和57株内生细菌,结合形态学观察和分子生物学鉴定,将284株内生真菌归属为担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)和接合菌门(Zygomycota)3门7纲11目18科的21个属38种菌。将57株内生细菌归属为放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)3门5纲7目12科13个属的细菌。其中,子囊菌门和接合菌门的内生真菌分离数几乎各占一半,接合菌门的内生真菌只有两种,二型伞霉的分离频率最高,而担子菌门的真菌仅有1株菌。子囊菌门的内生真菌多样性最为丰富,可归属于19个属35个种。同时进一步将内生真菌中分离频率高达44.7%的优势内生真菌确定为接合菌门(Zygomycota)伞状霉属(Umbelopsis)的二型伞霉(Umbelopsis dimorpha)。2.用樟叶越桔根中优势内生真菌二型伞霉的菌液浸泡接种于拟南芥种子中,以不同浓度的聚乙二醇(PEG)6000为胁迫剂,模拟干旱胁迫条件下优势内生真菌对拟南芥种子抗干旱促进萌发以及对根长的生长促进作用。试验结果显示,在水分正常的情况下,接菌的拟南芥种子的萌发速度比未接菌组快,平均根长为11.3cm,显著高于未接菌组6.76 cm的种子根长。随着干旱胁迫程度的不断增加,在10%~25%PEG浓度时,接菌的拟南芥种子的萌发速率和萌发率均显著高于对照组未接菌的种子,在15%~25%PEG浓度时,接菌后拟南芥种子的萌发率分别从81.10%、38.00%和0%提高到了92.10%、51.95%和4.81%,接菌的拟南芥种子的根长可高达未接菌组的两倍。表明樟叶越桔根中的优势内生真菌二型伞霉不仅可以在水分正常的情况下,促进拟南芥种子的萌发和根的生长,还能够在干旱胁迫的条件下提高种子的活力及萌发率,并且对种子的根长具有显著的促进作用。将樟叶越桔根中的优势内生真菌二型伞霉回接到樟叶越桔的组培苗中进行干旱胁迫试验,结果显示在水分正常的情况下,樟叶越桔根中优势内生真菌在植物正常的生长过程中有助于增强过氧化物酶(POD)的活性,在干旱胁迫下,接种优势内生真菌能够快速且显著的增强植物中POD的活性,有利于组培苗迅速调节自身的过氧化氢酶(CAT)活性,起到能够增强组培苗中CAT活性的作用,能够更加快速且明显的增强植物中脯氨酸的含量。同时,樟叶越桔根中优势内生真菌还能够提高组培苗的可溶性糖含量的调控响应速度,在干旱胁迫下有助于植物体中可溶性糖的累积。实验结果表明,樟叶越桔根中的优势内生真菌二型伞霉能够增强樟叶越桔抵御干旱的能力。3.运用植物化学的研究方法,将樟叶越桔根中的优势内生真菌二型伞霉进行发酵培养,发酵产物进行提取和萃取后分为甲醇部分和乙酸乙酯部分,进一步采用硅胶、Sephadex LH-20凝胶等多种柱层析和高效液相色谱半制备Rp-18方法进行分离纯化,从中共分离得到46个化合物,其中不重复的化合物34个(1-34)。采用MS、~1H和13C NMR波谱技术鉴定了14个化合物的化学结构,其中有3个化合物为新化合物。新化合物分别为dimorpharin A(5*)、dimorpharin B(17*)和dimorpharin C(18*),其余已鉴定的化合物分别为:2’-氧-甲基-腺嘌呤核苷(2’-O-methyladenosine,7)、4-羟基马尿酸甲酯(4-hydroxyhippuric acid methyl ester,8)、(S)-3-(4-羟基苯基)-2-羟基丙酸[(S)-2-hydroxy-3-(4′-hydroxyphenyl)propanoic acid,10]、latifolicinin C(11)、腺嘌呤(adenosine,13)、1-(β-D-ribofuranosyl)-1H-1,2,4-triazone(14)、β-胸腺嘧啶核苷(thymidine,20)、腺嘌呤核苷(adenosine,23)、2’-氧-甲基-鸟嘌呤核苷(2’-O-methylguanosine,27)、6’-O-咖啡酰熊果苷(6’-O-caffeoylarbutin,32)、2,4-二羟基-3,5,6-三甲基苯甲酸甲酯(methyl2,4-dihydroxy-3,5,6-trimethylbenzoate,33),所有化合物均为首次从二型伞霉中分离得到,其余化合物的化学结构正在鉴定中。