砷（As）是自然界分布极广的类金属元素,亚砷酸钠（NaAsO₂）是砷化物在环境中主要的存在形式。流行病学调查发现,慢性砷化物暴露可以引起多种癌症,其中主要是皮肤癌、肺癌和膀胱癌。因此,砷化物已被国际癌症协会确认为人类确定致癌物,但由于砷化物致癌的实验动物模型一直未能成功建立,从而使其致癌机制研究长期滞后,目前还没有一个被广泛认可且具有说服力的致癌机制。抑癌基因p⁵³功能改变在多种环境致癌物致癌过程中发挥重要作用,即环境致癌物通过引起突变或信号通路改变而抑制p⁵³功能,从而使细胞发生恶性转化和致瘤。然而不同于其他致癌物,砷化物是弱致突变剂,不易导致基因突变,且其对p⁵³的作用十分复杂,一般认为高水平砷化物通过引起DNA损伤而激活p⁵³,但低水平砷化物对p⁵³影响则取决于暴露程度、持续时间、及细胞类型等。p⁵³在砷化物所致细胞恶性转化及致癌过程中作用研究报道甚少,且其具体过程亦不清楚。为此,本课题拟建立低水平NaAsO₂长期慢性处理所致人胚肺成纤维细胞（HELF）和人皮肤角质形成细胞（HaCaT）恶性转化模型;应用二维电泳技术筛选差异蛋白质,进而通过分子生物学实验方法探讨低水平NaAsO₂所致HELF及HaCaT细胞恶性转化过程中p⁵³功能失活机制,揭示低水平NaAsO₂所致细胞恶性转化的部分分子机制,从而为进一步理解砷化物致癌的分子机制和寻找砷中毒的生物学标志及防治措施提供一定的科学依据。方法一、建立低水平亚砷酸钠所致细胞恶性转化模型分别常规培养HELF或HaCaT细胞24 h后,再分别用含0.0、0.5、1.0和2.0μM NaAsO₂的DMEM培养液培养HELF细胞,或用含0.0、1.0μM NaAsO₂的1640培养液培养HaCaT细胞,均再培养48⁷2 h,如此重复培养两种细胞30代（约15 w）后,观察细胞恶性程度。二、软琼脂集落形成实验将恶性转化和相关对照的HELF、HaCaT和肺腺癌A549细胞（阳参）与含0.7%低熔点琼脂糖培养液等体积混合后,铺于含0.7%低熔点琼脂糖的底层培养基上,待其凝固后,表面覆以适量培养液,37℃,5% CO2培养3⁴ d换液,4 w后终止培养并计数细胞集落数。三、裸鼠皮下致瘤实验将恶性转化和相关对照的HELF、HaCaT和A549细胞按1×10⁷/0.2 mL密度注射于Balb/c裸鼠右侧腋窝皮下,饲养4 w后将肿瘤组织取出,测量肿瘤体积,并作组织切片、HE染色后进行组织病理学鉴定。四、测序法鉴定恶性转化HELF细胞p⁵³基因编码区序列通过对1.0μM NaAsO₂所致恶性转化HELF细胞的p⁵³基因编码区序列分段扩增和测序后,将测序结果与Genebank中p⁵³基因编码区序列进行比对,以判断是否存在基因突变。五、恶性转化HELF细胞差异蛋白质分析通过蛋白质二维电泳、凝胶分析及质谱检测,发现低水平NaAsO₂所致恶性转化HELF细胞与传代对照细胞蛋白表达差异及相关蛋白名称和相关信息。六、Western blot提取细胞总蛋白并测定浓度,然后用SDS-PAGE分离蛋白、半干法转膜,用特异性一抗孵育过夜,进一步结合二抗后,用增强型化学发光法检测相关蛋白表达及磷酸化水平。七、Southwestern blot提取HaCaT细胞总蛋白,SDS-PAGE分离、半干法转膜后,将膜变性、复性,用生物素标记的mot-2基因启动子序列DNA探针与膜杂交,通过化学发光法检测mot-2基因启动子序列DNA与NF-κB的结合情况。八、免疫共沉淀（IP）提取细胞总蛋白,用IP抗体与总蛋白混合过夜将靶蛋白沉淀后,用Western blot检测蛋白-蛋白相互作用或用Southwestern blot检测DNA-蛋白相互作用。九、免疫荧光法检测p⁵³的核转位水平将1.0μM NaAsO₂处理和相关对照HELF和HaCaT细胞用兔抗人p-p⁵³一抗孵育24 h后,用Cy3标记的山羊抗兔二抗孵育1 h,用DAPI将细胞核染色15 min后荧光显微镜下观察核内p-p⁵³表达水平,并用TECAN多功能酶标仪测定核内p-p⁵³荧光强度。结果一、低水平亚砷酸钠慢性处理所致细胞生物学特性变化分别用含0.0、0.5、1.0和2.0μM NaAsO₂的DMEM培养液处理HELF细胞30代后或用含0.0、1.0μM NaAsO₂的1640培养液处理HaCaT细胞30代后,两种恶性转化细胞的形态和生长方式均发生明显改变,倍增时间明显缩短;且1.0μM NaAsO₂所致恶性转化HELF细胞生长动力学改变更明显。二、低水平亚砷酸钠慢性处理所致细胞恶性转化和致瘤性0.5、1.0和2.0μM NaAsO₂所致恶性转化HELF细胞和1.0μM NaAsO₂所致恶性转化HaCaT细胞均能在软琼脂培养基上形成细胞集落,且能在裸鼠皮下形成肿瘤;肿瘤组织病理学切片显示为:恶性转化HELF细胞形成低分化梭形细胞瘤,恶性转化HaCaT细胞形成低分化鳞癌;且1.0μM NaAsO₂所致恶性转化HELF细胞的软琼脂细胞集落数更多、肿瘤体积更大。从而说明低水平砷化物慢性处理可引起HELF和HaCaT细胞恶性转化并具有致瘤性。三、恶性转化HELF细胞p⁵³基因编码区序列将1.0μM NaAsO₂所致恶性转化HELF细胞p⁵³基因编码区序列分段扩增、测序和比对发现,测序结果与Genebank中p⁵³基因编码区序列100%匹配,说明低水平NaAsO₂所致HEFL细胞恶性转化未引起p⁵³基因编码区序列突变。四、恶性转化HELF细胞差异蛋白分析应用二维电泳在0.5、1.0和2.0μM NaAsO₂所致恶性转化HELF细胞与传代对照细胞中共鉴定出5671个蛋白位点,其中126个蛋白存在显著差异;应用质谱检测确定17个差异有意义蛋白的名称和相关信息,其中包括与p⁵³功能失活相关的核因子κB（NF-κB）抑制因子（NKRF）和mot-2;且发现低水平NaAsO₂所致恶性转化HELF细胞中NKRF表达降低而mot-2表达升高。五、恶性转化HELF细胞NKRF、mot-2和p-Rel表达水平Western blot也发现0.5、1.0和2.0μM NaAsO₂所致恶性转化HELF细胞中NKRF表达降低而mot-2和p-RelA表达水平升高;且1.0μM NaAsO₂所致恶性转化HELF细胞的这些指标改变更明显;进一步发现随着1.0μM NaAsO₂处理HELF细胞代数增加,NKRF表达水平降低越明显,而mot-2和p-RelA表达水平升高越明显。结果提示mot-2高表达和NF-κB激活可能参与了低水平NaAsO₂所致HELF细胞恶性转化。六、低水平亚砷酸钠激活NF-κB1.0μM NaAsO₂和1.0μM过氧化氢（H₂O₂）引起HELF细胞活性氧（ROS）水平及p-IKKβ、p-IκBα、p-RelA和mot-2表达水平升高,而过氧化氢酶则可阻滞此作用;同时也发现1.0μM NaAsO₂引起HaCaT细胞p-RelA水平表达升高。结果显示低水平NaAsO₂通过ROS激活IKKβ,进而磷酸化IκBα,最终激活NF-κB,且mot-2的表达和NF-κB的激活呈同一趋势。七、低水平亚砷酸钠处理细胞中NF-κB调控mot-2表达（一）低水平亚砷酸钠处理HaCaT细胞中mot-2与NF-κB相互作用Mot-2基因启动子区存在一段类似κB序列的核苷酸链,Southwestern blot实验证实,mot-2基因启动子序列DNA探针或RelA抗体在同一张膜上分别杂交或结合到一个60⁷0 kD蛋白;且进一步再用IP-Southwestern blot实验发现,mot-2基因启动子序列DNA探针也杂交到一个60⁷0 kD蛋白。结果显示低水平NaAsO₂处理HaCaT细胞中mot-2基因与NF-κB相互作用。（二）低水平亚砷酸钠处理HELF细胞中NF-κB调控mot-2表达1.0μM NaAsO₂组和1.0μM NaAsO₂+Con siNRA组HELF细胞mot-2、p-IκBa和p-RelA蛋白及mot-2 mRNA表达水平显著高于对照组、Bay11-7082（NF-κB抑制剂）或RelA siRNA预处理组,说明阻滞或关闭NF-κB后,低水平NaAsO₂引起mot-2蛋白或mRNA表达升高现象消失,结果显示低水平NaAsO₂处理HELF细胞中NF-κB调控mot-2表达。（三）低水平亚砷酸钠处理HaCaT细胞中NF-κB调控mot-2表达1.0μM NaAsO₂组HaCaT细胞mot-2和p-RelA蛋白表达水平显著高于对照组和Bay11-7082预处理组,说明阻滞NF-κB后,低水平NaAsO₂引起mot-2升高现象消失,结果显示低水平NaAsO₂处理HaCaT细胞中NF-κB调控mot-2表达。八、低水平亚砷酸钠处理细胞中NF-κB通过mot-2阻止p⁵³的磷酸化及核转位（一） HELF细胞中NF-κB通过mot-2调控p⁵³磷酸化及核转位1.0μM NaAsO₂组和1.0μM NaAsO₂+Con siNRA组与对照组、Bay11-7082、RelA siRNA或mot-2 siRNA预处理组比较,HELF细胞mot-2、p-IκBa和p-RelA蛋白表达水平升高,而p-p⁵³蛋白表达水平和核内荧光强度均降低,说明阻滞或关闭NF-κB或mot-2后,低水平NaAsO₂引起p⁵³磷酸化及核转位水平进一步增强,结果显示低水平NaAsO₂处理HELF细胞中NF-κB通过mot-2调控p⁵³磷酸化及核转位。（二） HaCaT细胞中NF-κB通过mot-2调控p⁵³磷酸化及核转位1.0μM NaAsO₂组与对照组、Bay11-7082或mot-2 siRNA预处理组比较,HaCaT细胞mot-2蛋白表达水平升高,而p-p⁵³蛋白表达水平和核内荧光强度均降低,说明阻滞NF-κB或关闭mot-2后,低水平NaAsO₂引起p⁵³磷酸化和核转位水平进一步增强,结果显示低水平NaAsO₂处理HaCaT细胞中NF-κB通过mot-2调控p⁵³磷酸化和核转位。九、低水平亚砷酸钠处理HELF细胞中NF-κB通过mot-2阻止p⁵³与CBP结合（一） NF-κB调控mot-2与p⁵³的相互作用1.0μM NaAsO₂组和1.0μM NaAsO₂+Con siNRA组HELF细胞中与p⁵³结合的mot-2水平显著高于对照组、Bay11-7082或RelA siRNA预处理组,说明阻滞或关闭NF-κB后,低水平NaAsO₂引起mot-2与p⁵³结合量下降,结果显示低水平NaAsO₂处理HELF细胞中NF-κB调控mot-2与p⁵³相互作用。（二） mot-2介导NF-κB与p⁵³竞争性结合CBP1.0μM NaAsO₂组与对照组或Bay11-7082预处理组比较,在mot-2野生型HELF细胞中,主要与CBP结合的RelA水平显著升高;而在mot-2缺陷型HELF细胞中,主要与CBP结合的p⁵³水平略有下降。结果显示低水平NaAsO₂处理HELF细胞中mot-2介导NF-κB与p⁵³竞争性结合CBP。十、阻滞NF-κB信号通路可阻止低水平亚砷酸钠所致细胞恶性转化和致瘤性1.0μM NaAsO₂组慢性处理所致恶性转化HELF细胞和HaCaT细胞在软琼脂培养基上形成细胞集落数和在裸鼠皮下形成肿瘤体积均大于对照组和Bay11-7082预处理组;肿瘤组织病理学切片显示为:恶性转化HELF细胞形成低分化梭形细胞瘤,而恶性转化HaCaT细胞形成低分化鳞癌;从而说明NF-κB信号通路在低水平NaAsO₂所致HELF细胞和HaCaT细胞恶性转化和致瘤性中发挥重要作用。结论1.低水平NaAsO₂慢性处理可引起HELF及HaCaT细胞发生恶性转化且具有致瘤性。2.低水平NaAsO₂所致恶性转化HELF细胞中未发现p⁵³基因编码区序列突变。3.低水平NaAsO₂处理HELF和HaCaT细胞能够通过激活NF-κB,转录调控mot-2表达,进而阻止p⁵³入核磷酸化与CBP结合。4.阻滞NF-κB信号通路可阻止低水平NaAsO₂所致HELF和HaCaT细胞恶性转化及致瘤性。