论文部分内容阅读
背景：卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)感染与卡波济肉瘤(Kaposi’s sarcoma, KS)的发生密切相关。人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)感染可显著提高KSHV感染者罹患KS的风险。然而,艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)相关的KS (AIDS-KS)详细发病机制目前尚不清楚。我们前期的研究发现,HIV-1 Tat蛋白不仅可以通过调控JAK/STAT通路来调节KSHV潜伏/复制,而且能够增强KSHV编码的Kaposin A致瘤作用。与Tat类似,HIV-1另一早期、分泌性蛋白Nef是否有可能影响KSHV致瘤蛋白K1诱导血管和肿瘤形成,从而参与AIDS-KS的发生?目的：研究HIV-1负性因子(negative factor, Nef)对KSHV编码的K1蛋白诱导的血管生成和肿瘤形成的影响及其有可能涉及到的信号通路。方法：首先构建携带KSHV K1基因的重组慢病毒(K1),并用其空载体(Mock)作为对照,分别感染EA.hy926细胞,根据细胞中表达的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)进行流式分选,快速筛选出GFP表达阳性的细胞群(EA/K1和EA/Mock)。分别用包装好的重组慢病毒Nef及其对照Mock感染上述两株细胞。分别采用CCK-8、平板克隆、流式细胞术及微管形成等实验对病毒感染细胞进行细胞增殖、克隆形成、细胞周期和微管形成进行分析。运用鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane, CAM)模型与裸鼠体内成瘤试验观察Nef蛋白对KSHV K1诱导血管生成和肿瘤形成的影响。采用过表达信号通路中相关激酶的cDNA和显性负相质粒(dominant-negative construct),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)预处理细胞,借助CAM模型和裸鼠成瘤实验检测PI3K/PTEN/Akt/mTOR信号通路在Nef蛋白影响KSHV K1诱导血管生成和肿瘤形成中的作用。同时,IHC检测血管内皮细胞标志蛋白CD31和SMA及肿瘤组织中与血管生成密切相关的血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达。结果：CCK-8、平板克隆、流式细胞术和体外微管形成实验结果显示,Nef蛋白能够促进KSHV K1诱导的细胞增殖、克隆形成、细胞从G0/G1期向S期转换以及微管形成。CAM模型和裸鼠肿瘤形成试验均表明,Nef蛋白能够在体内增强K1诱导的血管生成和肿瘤形成能力。机制方面的研究发现,Nef能够促进K1活化的PI3K/Akt/mTOR信号通路；过表达PTEN或抑制P13K和Akt的磷酸化水平均能够显著抑制Nef蛋白促进K1诱导的血管生成和肿瘤形成。IHC结果显示,Nef增强K1诱导血管生成和肿瘤形成的同时也促进了CD31、SMA和VEGF的表达。结论：HIV-1 Nef通过调控PI3K/PTEN/Akt/mTOR信号通路促进KSHV K1诱导的细胞增殖、血管生成和肿瘤形成。提示,PI3K/PTEN/Akt/mTOR信号通路可作为临床治疗AIDS-KS肿瘤的一个潜在的作用靶点。