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研究背景:缺氧性肺动脉高压（Hypoxia-induced Pulmonary Hypertension,HPH）是一种由于长期慢性缺氧刺激导致的呼吸系统疾病。其主要特征为低氧性肺动脉收缩、肺动脉结构重塑,以及肺动脉压力升高。随着病情持续性发展,右心室持续超负荷工作,最终导致右心室功能衰竭。目前,临床上并没有治愈肺动脉高压的确切治疗方法。因此,进一步探索HPH的发病机制,寻找有效的治疗方案对治疗HPH具有重要意义。HPH发病机制复杂,包括多种病理过程。缺氧诱发的肺动脉血管平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC）异常增殖和迁移被认为是造成肺动脉血管过度收缩和重塑的重要因素。然而,其分子病理机制研究尚未明确。水通道蛋白1（Aquaporin 1,AQP1）是水通道蛋白家族中的重要成员,在多种生理和病理过程中发挥重要作用,引起日益广泛的关注。研究表明,AQP1的高表达能够促进多种肿瘤细胞增殖、转移和肿瘤血管生成。在肺组织中,AQP1主要在II型肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞以及肺动脉血管中膜的平滑肌细胞表达。低氧刺激能上调AQP1,同时下调AQP5在动物肺组织中的表达水平,而其他AQPs表达水平不发生明显变化。体外实验证实,AQP1的表达水平上调与低氧诱发的PASMCs增殖和迁移存在关系。但是,AQP1在HPH发病中的直接作用尚无报道。本课题旨在通过对AQP1基因缺失小鼠进行慢性缺氧处理,建立肺动脉高压模型,探究AQP1在HPH发生发展中的作用及其机制。方法1.HPH动物模型的建立及分组选取鼠龄为10-12周的雄性野生型CD1和AQP1基因敲除型CD1小鼠各14只,随机分成4组:（1）野生型常氧组;（2）野生型低氧组;（3）敲除常氧组;（4）敲除低氧组。10只雄性Sprague-Dawley大鼠（200-250g）随机分成2组,每组5只:（5）大鼠常氧组;（6）大鼠低氧组。第（1）组、（3）组和（5）组鼠在正常氧（21%O2）环境中饲养;第（2）、（4）组和（6）组鼠在低氧（10%O2）环境中饲养,连续处理4周。2.AQP1在HPH动物肺组织及肺小动脉中的表达检测低氧处理4周后,取各组大、小鼠肺组织,左肺组织经研磨提取蛋白,通过Western Blot检测各组肺组织中AQP1蛋白的表达水平。动物右肺组织经多聚甲醛固定,石蜡包埋、切片,进行α-肌动蛋白（α-SMA）抗体和AQP1抗体免疫荧光共染,分析AQP1在肺小动脉的表达情况。3.缺氧性肺动脉高压小鼠肺动脉血液动力学和组织形态学分析小鼠麻醉后,经颈右侧外静脉插入导管检测并记录右心室收缩压力（RVSP）。然后剪取心脏,分离右心室（RV）,左心室+室间隔（LV+S）,分别称重,计算其重量比值（RV/LV+S）作为评价右心室肥厚的指标。小鼠肺组织和部分小鼠心脏经多聚甲醛固定,石蜡包埋、切片,进行HE染色和EVG染色。采用Image Pro Plus病理图像分析系统测量肺动脉中膜面积、血管面积,并计算中膜面积百分比（WA%）以评价肺小动脉增厚程度。小鼠心脏横切面通过HE染色观察右心室肥厚程度。4.HPH模型小鼠肺小动脉重构免疫组化检测小鼠肺组织石蜡切片利用α-SMA抗体、PCNA抗体和CD31抗体进行免疫组化染色。5.AQP1基因缺失对肺组织中低氧诱导因子（HIF）表达影响检测提取各组小鼠肺组织蛋白,通过Western Blot检测HIF-1α、HIF-2α表达情况。6.原代培养PASMC及PASMC细胞增殖、周期、凋亡和迁移的检测分析（1）应用胶原酶消化贴壁的方法,分别培养野生型和AQP1基因敲除型小鼠的原代肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）,以α-SMA免疫荧光染色进行鉴定,并取3至5代用于实验。将细胞实验分成4组:野生常氧组、野生低氧组、敲除常氧组和敲除低氧组。（2）应用Western Blot技术和细胞免疫荧光方法分析缺氧处理后肺动脉血管平滑肌细胞AQP1的表达情况。（3）MTT试验、Ki67抗体细胞免疫荧光以及PCNA、c-Myc抗体Western Blot研究AQP1基因敲除对低氧诱导的肺动脉血管平滑肌细胞异常增殖的影响。（4）通过Western Blot检测AQP1基因敲除对PASMCs细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白表达水平的影响。（5）通过划痕实验和罗丹明-鬼笔环肽染色分析AQP1基因缺失对低氧诱发的PASMC迁移和细胞骨架重构的作用。结果:1.在大鼠和小鼠缺氧性肺动脉高压动物模型中,慢性低氧刺激上调AQP1在肺组织中的表达水平。在低氧导致重塑的肺动脉血管内皮层和中膜平滑肌细胞层中AQP1表达水平明显升高。2.野生低氧组小鼠RVSP、RV/LV+S明显高于野生常氧组小鼠;AQP1基因敲除低氧组小鼠RVSP、RV/LV+S均明显低于野生低氧组小鼠。3.野生低氧组小鼠肺动脉WA%、PCNA阳性细胞率、α-SMA光密度值、CD31阳性细胞以及肺血管肌化比率显著高于野生常氧组小鼠,肺血管重塑明显;AQP1基因敲除低氧组小鼠肺动脉WA%、PCNA阳性细胞率、α-SMA光密度值、CD31阳性细胞以及肺血管肌化比率均明显低于野生低氧组小鼠,肺血管重塑有明显缓解。4.低氧处理上调小鼠肺组织中HIF-1α、HIF-2α的蛋白表达水平,AQP1基因缺失减弱低氧对HIF-1α、HIF-2α在肺组织中的表达上调。5.低氧刺激上调AQP1在PASMCs细胞中的表达水平;AQP1基因缺失抑制PASMCs细胞增殖活性,而且抑制效应在低氧环境下更明显。6.低氧刺激时野生型PASMCs细胞Ki67阳性率和PCNA表达水平明显升高,PASMCs细胞AQP1基因缺失抑制Ki67阳性细胞率和PCNA表达水平的升高。7.在PASMCs细胞中,AQP1基因缺失,下调Cyclin D表达,上调p27表达,并且提高细胞凋亡相关蛋白cleaved-PARP、cleaved-caspase 9以及cleaved-caspase3的表达水平。8.AQP1缺失抑制PASMCs细胞骨架重构,和细胞恶性迁移能力。结论:1.慢性低氧上调AQP1在肺组织以及肺小动脉血管内皮层和中膜平滑肌细胞层的表达水平。2.AQP1基因缺失改善缺氧性肺动脉高压模型中肺动脉压力升高和肺动脉结构重构。3.AQP1基因缺失降低缺氧诱导的HIF高表达水平。4.AQP1基因缺失减弱低氧诱发的PASMCs的过度增殖,阻滞PASMCs细胞周期进程并促进PASMCs细胞凋亡。5.AQP1基因抑制缺氧诱发的PASMCs细胞迁移和细胞骨架重组。