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细胞凋亡(apoptosis)是指在多细胞生物体中由多种因子介导的细胞主动死亡的过程。自从上世纪90年代初开始,在哺乳动物、线虫和果蝇中细胞凋亡的研究已经非常广泛并且深入,其凋亡的分子机制也取得了很大进展。目前关于细胞凋亡的途径主要有两种,其中线粒体凋亡通路是其主要的途径。虽然细胞凋亡的分子机制在进化过程之中高度保守,但研究发现在线粒体介导的内源性凋亡途径中,哺乳动物是通过线粒体释放细胞色素C到胞质中引起细胞凋亡,而在果蝇和线虫的细胞凋亡中却与此不同。但是在鳞翅目昆虫细胞凋亡的研究中却发现细胞色素C的作用与哺乳动物相似,凋亡过程有细胞色素C释放事件。鉴于迄今为止关于鳞翅目昆虫细胞凋亡过程中细胞色素C释放的检测、定位或者无细胞体系研究均是以哺乳动物细胞色素C和抗体进行的,为了阐明细胞色素C在鳞翅目昆虫细胞凋亡过程中的作用及分子机制,我们将斜纹夜蛾细胞色素C的原核表达重组质粒(pET-28a-Cyt C)进行蛋白诱导表达纯化,将纯化出的内源性Cyt C蛋白用于斜纹夜蛾无细胞凋亡体系的研究；同时构建斜纹夜蛾Cyt C的真核表达载体,将其转染SL-1细胞,最终运用形态学观察,荧光定量法及细胞流式技术来检测内源性Cyt C在SL-1细胞凋亡中的作用。首先我们利用本实验室已经构建成功的斜纹夜蛾细胞色素C的原核表达重组质粒pET-28a-Cyt C, IPTG诱导表达,结果为在24℃,0.4mM IPTG,诱导8小时,发现目的蛋白在上清表达,表达的产物用His抗体进行验证,发现目的蛋白大小为15KD,将含有目的蛋白的上清粗提培养液过镍柱进行亲和层析纯化,咪唑洗脱,发现350mM咪唑可以洗脱下目的蛋白,洗脱下来的目的蛋白经过离心过滤器除去咪唑,得到纯化的内源性细胞色素C目的蛋白。将获得的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳,并切胶免疫兔子四次,获得SL-1-Cyt C多克隆抗体。纯化的目的蛋白用于SL-1无细胞体系的研究,发现内源性的Cyt C蛋白在SL-1无细胞凋亡体系中诱导细胞核发生了凋亡；而同时加入细胞色素C抗体和纯化的目的蛋白则可以抑制细胞凋亡。本研究同时还成功构建了斜纹夜蛾Cyt C的真核表达载体PIE1-Cytc-EGFP, PIE1-EGFP-Cytc及其空载PIE1-EGFP-C1三种质粒,将其转染SL-1细胞,、vestern blot检测融合蛋白的表达,同时利用线粒体荧光染料和GFP来观察细胞色素C在细胞中的定位,转染成功后通过DAPI染色观察细胞核凋亡,荧光定量法测下游caspase-3活性以及细胞流式技术一起验证内源性细胞色素C在SL-1细胞凋亡中的作用,结果发现内源性的Cyt C蛋白发挥了诱导细胞发生凋亡的现象,而且还发现细胞色素C插入载体的位置不同,导致引起的凋亡率也不同。综上所述,我们发现了内源性Cyt C参与了细胞凋亡过程,同时也证明了在SL-1的细胞凋亡中存在线粒体Cyt C介导的凋亡通路。