[研究背景]肺动脉高压(Pulmonary hypertension,PH)是一组严重的进行性肺动脉重塑性疾病,诊断标准为平均肺动脉压≥25 mmHg,最终将导致肺血管阻力增加、右心室衰竭。根据其病因可分为动脉性肺动脉高压、左心疾病所致肺动脉高压、缺氧和/或肺部疾病引起的肺动脉高压、慢性血栓栓塞性肺动脉高压、多种机制和/或不明机制引起的肺动脉高压,其中动脉性肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是肺动脉高压五大类中的第一大类。临床上以钙离子拮抗剂、内皮素受体拮抗剂等药物治疗为主,但大部分患者疗效不佳,预后极差,中位生存期仅为2-8年。因此深入探究PAH的发病机制,积极探索治疗PAH的新靶点,将为PAH的预防和治疗,提高患者生活质量具有重要意义。PAH最主要的病理组织学特征是远端微小肺动脉血管重构。细胞代谢异常、内质网异常应激、钙稳态、线粒体功能及结构失调、表观遗传学异常修饰等均可导致肺血管中膜血管平滑肌由收缩型向合成型转化,合成型平滑肌具有更强的增殖、迁移能力,最终形成PAH典型血管丛状病变,表现为小血管呈丛状、网状或球样,或裂隙状杂乱增生重构。因此,进一步研究肺血管平滑肌细胞的功能及调控机制,将为PAH的治疗提供更多的理论基础和实验依据。近年来的研究证实,PAH与体内雌激素(E2)水平有关。流行病学资料显示PAH好发于女性,女性患病率为男性2-4倍。提示高水平E2可能促进PAH的发生和发展。进一步研究E2在PAH发生和发展中的作用及其分子机制,对选择有效的干预措施(雌激素替代疗法或拮抗疗法)和探索PAH防治新型靶点均具有重要意义。研究显示,PFKFB3在PAH中起关键促进作用。PFKFB3(磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3,phosphofructo kinase-2/fructose-2,6-bisphos phatase 3)是糖酵解(葡萄糖转化为乳酸并提供能量)的关键促进酶,其表达增高促进乳酸增多,进而刺激血管新生。此外,PFKFB3可激活细胞周期蛋白依赖性激酶,促进细胞增殖。肺血管平滑肌细胞PFKFB3可增加糖酵解水平,激活依赖ERK1/2的钙激活中性蛋白酶2磷酸化,促进平滑肌细胞的异常增殖,加速并加重肺血管重构。有研究显示E2可诱导MCF-7细胞中PFKFB3的表达,促进癌细胞的增殖和迁移。提示E2同样可能通过影响肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达,促进肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移,进而影响肺动脉高压的发生发展。因此,本课题将以PFKFB3为切入点,探讨E2在促进肺血管平滑肌增殖、迁移中的关键作用。新近研究显示,m6A作为mRNA最为普遍的修饰方式,在转录后调控发挥重要作用。m6A是指对mRNA上的腺嘌呤(A)进行甲基化修饰。这一修饰过程可逆,由甲基化转移酶(Writers)、去甲基化酶(Erasers)和甲基化阅读蛋白(Readers)等共同参与,广泛参与哺乳动物的生殖发育、免疫、代谢、肿瘤生成和转移等过程。近期研究显示,甲基化转移酶3(METTL3)可以促进几种关键癌蛋白的表达,其高表达可增强癌细胞的增殖,迁移和侵袭。目前尚未有E2影响m6A修饰调控靶蛋白的报道。因此我们推测E2是否通过调控m6A mRNA甲基化酶METTL3表达,进而调控PFKFB3蛋白表达,影响肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移,这是本课题所研究的内容。为进一步验证E2通过METTL3促进PFKFB3的表达对PAH发生和发展的影响,本课题在整体动物水平上确认METTL3/PFKFB3在E2促进PAH发生、发展中的重要作用,即在MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型+卵巢去势(OVX)模型中,通过免疫组织化学方法、Western blot、m6A检测试剂盒以及实时RT-PCR法检测各组大鼠模型METTL3/PFKFB3的表达水平,观察METTL3/PFKFB3在E2促进PAH发生和发展中的关键作用。[研究目的]本课题拟探讨E2通过调控METTL3上调PFKFB3的蛋白表达,进而促进肺血管平滑肌功能、促进肺动脉高压的发生发展,并研究其分子调控机制,证实METTL3/PFKFB3在E2促进肺动脉高压的发生和发展中的重要作用。[研究方法与结果]1.E2促进MCT诱导的PAH大鼠模型的发展1.1 E2促进MCT诱导的PAH大鼠模型的疾病进展体重为200-250g的实验用6-8周龄成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,给予正常饮食,随机分成6组(每组6只)。分组为:a)假手术组;b)OVX组;c)OVX+E2组。OVX组于颈部皮下植入17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)缓释片(0.25mg E2/60 days)。上述处理完成后恢复1周,即行常氧PAH造模:雌性SD大鼠一次性大腿前侧皮下注射野百合碱(MCT,50mg/kg),对照组SD大鼠(假手术组、OVX组、OVX+E2组)注射相同体积剂量的生理盐水,置于SPF级动物房饲养,给予正常饮食。上述各组大鼠接受处理4周后,检测相关指标。1.1.1 MCT诱导的PAH各组大鼠模型血清中E2水平检测上述各组共36只成年雌性Sprague-Dawley大鼠,平均6-8周龄,采集血清,检测各组大鼠血清中17β-雌二醇(E2)表达水平。结果显示:与假手术组(Sham组)相比,OVX组大鼠血清E2水平明显降低,OVX+E2组大鼠血清E2水平较于OVX组明显增加,增加率为(165.3±23.7)%(n=6,P<0.01);与Sham组相比,Sham+MCT组大鼠血清E2水平显著增加,增加率为(155.3±26.7)%(n=6,P<0.01),OVX+MCT 组较于 Sham+MCT 组大鼠血清 E2 水平降低,但仍高于Sham组大鼠;而补充E2缓释片后的OVX+MCT+E2组(n=6)大鼠血清中E2水平显著高于OVX+MCT组,说明MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型体内血清E2水平高于正常大鼠(n=6,P<0.01)。1.1.2 E2对MCT诱导的PAH大鼠模型右心室收缩压的影响结果显示:经皮下注射生理盐水的各组大鼠(n=6)右心室收缩压(RVSP)、在正常范围之内,与Sham+MCT组(n=6)比较,OVX+MCT组大鼠RVSP明显降低,降低率为(168.6±20.7)%(n=6,P<0.01);与OVX+MCT组比较,补充E2缓释片后的 OVX+MCT+E2 组大鼠 RVSP 明显增加,增加率为(150.6±18.9)%(n=6,P<0.01)。1.1.3 E2对MCT诱导的PAH大鼠模型右心肥厚指数的影响对各组大鼠采集完血流动力学指标后,打开胸腔取出心肺组织,分别测定各组大鼠右心肥厚指数。经皮下注射生理盐水的各组大鼠(n=6)右心肥厚指数(RI)在正常范围之内,与Sham+MCT组(n=6)比较,OVX+MCT组大鼠RI显著降低,降低率分别为(258.3+23.7)%(n=6,P<0.01);与 OVX+MCT 组比较,补充 E2 缓释片后的OVX+MCT+E2组大鼠RI明显增加,增加率分别为(223.3±21.8)%(n=6,P<0.01)。1.1.4 E2对MCT诱导的PAH大鼠模型肺部组织病理改变的影响右心肥厚指数测定完成后行肺组织石蜡切片,伊红(HE)染色,观察各组大鼠肺部组织病理改变、远端肺小血管的中膜厚度。结果显示:经皮下注射生理盐水的各组大鼠(n=6)组大鼠的远端肺小血管的内膜完整,平滑肌层细胞排列规则,没有炎症细胞的浸润,全层无增厚。相对比Sham+生理盐水(n=6)、OVX+生理盐水(n=6)、OVX+E2+生理盐水(n=6)组,肺部组织免疫组化染色切片结果显示Sham+MCT组(n=6)大鼠的平滑肌细胞和细胞核的排列紊乱,平滑肌层增厚,血管管腔狭窄,肺血管及肺组织中有较多的中性粒细胞以及淋巴细胞的浸润;与Sham+MCT组(n=6)比较,OVX+MCT组(n=6)大鼠血管中膜厚度明显减少,减少率为(218.6±20.7)%(n=6,P<0.01),在上述肺小血管组织病理上的变化有所改善;与OVX+MCT组(n=6)比较,补充E2缓释片后的OVX+MCT+E2组大鼠血管中膜厚度明显增加,增加率为(226.6±19.8)%(n=6,P<0.01),上述肺小血管组织病理的变化显著恶化。1.2 E2促进MCT诱导的PAH大鼠模型肺动脉平滑肌层PFKFB3蛋白的表达将上述各组大鼠的远端肺小动脉从肺组织中分离,用显微镊将其外膜和内膜剥离干净后,冻存在-80℃冰箱中,随后将分离好的肺小动脉平滑肌层取出并称重并按一定的比例分别加入肺组织裂解液,使用机械匀浆器进行匀浆后放置于冰上,使用超声波破碎仪进行破碎、离心,留取上清液并分装于1.5 ml的离心管中,放置于-80℃冰箱进行保存。通过BCA法测定蛋白浓度后,利用Western blot法检测各组大鼠远端肺小动脉中PFKFB3的蛋白表达情况。用Trizol法提取肺小动脉平滑肌层RNA,用实时RT-PCR法检测各组大鼠远端肺小动脉中PFKFB3的mRNA表达情况。结果显示:与经颈部注射生理盐水的各组大鼠相比,Western blot和RT-PCR显示Sham+MCT组大鼠远端肺小动脉的PFKFB3的蛋白表达明显增加,增加率为(151.6±18.6)%(n=6,P<0.01),PFKFB3 mRNA 水平无明显变化;与 Sham+MCT 组比较,OVX+MCT组大鼠远端肺小动脉的PFKFB3的蛋白表达明显降低,降低率为(152.8±19.6)%(n=6,P<0.01),PFKFB3 mRNA 水平无明显变化;与 OVX+MCT 组比较,补充E2缓释片后的OVX+MCT+E2组大鼠远端肺小动脉的PFKFB3的蛋白表达明显增加,增加率为(268.6±25.7)%(n=6,P<0.01),PFKFB3 mRNA水平无明显变化。2.E2增加肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达的作用机制2.1 E2上调肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达2.1.1不同浓度E2处理相同时间,增加肺血管平滑肌细胞PFKFB3蛋白表达,不影响肺血管平滑肌细胞PFKFB3 mRNA表达。体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),给予不同浓度梯度(1nM-1μM)的E2处理24 h,应用Western blot方法观察PFKFB3蛋白表达情况,应用实时RT-PCR法观察PFKFB3 mRNA表达水平。结果显示:与对照组比较,分别给予不同浓度的E2(1 nM-1uM)处理24 h后,均能增加PFKFB3蛋白表达,增加率分别为(205.3±28.5)%(n=3,P<0.01)、(225.6±25.7)%(n=3,P<0.01)、(180.3±23.5)%(n=3,P<0.01)、(165.6±22.7)%(n=3,P<0.01),而对PFKFB3 mRNA表达无明显影响。2.1.2同一浓度E2处理不同时间,增加肺血管平滑肌细胞PFKFB3蛋白表达,不影响肺血管平滑肌细胞PFKFB3 mRNA表达。体外培养PASMCs,给予E2(10nM)分别处理大鼠肺动脉平滑肌细胞不同时间(2h,4h,6h,8h,12h,24h)后,应用Western blot法观察PFKFB3蛋白表达水平,应用实时RT-PCR法观察PFKFB3 mRNA表达水平。结果显示:与对照组比较,分别给予E2(10 nM)处理2h,4h,6h,8h,12h,24h后,均能增加PFKFB3蛋白表达,增加率分别为(165.3±28.5)%(n=3,P<0.01)、(180.6±25.7)%(n=3,P<0.01)、(220.3±23.5)%(n=3,P<0.01)、(265.6±25.7)(n=3,P<0.01)、(320.3±21.5)%(n=3,P<0.01)、(150.6±23.7)%(n=3,P<0.01),而对 PFKFB3 mRNA 表达无明显影响。2.2 E2通过ERα上调肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达体外培养 PASMCs,分别用 E2(10 nM),PPT(ERα 激动剂,1 nM),DPN(ERβ 激动剂,1 nM),MPP(ERα 抑制剂,1nM),PHTPP(ERβ抑制剂,1nM),G15(GPR30抑制剂,1nM)处理大鼠肺动脉平滑肌细胞24 h,用Western blot法检测PFKFB3蛋白表达情况。结果显示,E2,PPT均能上调PFKFB3蛋白表达,上调幅度分别为(150.3±18.5)%(n=3,P<0.01)、(280.6±21.7)%(n=3,P<0.01),而 DPN 上调作用不明显;E2 上调 PFKFB3的作用可被MPP所抑制,而不能被PHTPP或G15所抑制。结果说明,ERα参与E2上调PFKFB3蛋白表达的作用。2.3 E2通过上调PFKFB3蛋白表达促进肺血管平滑肌细胞的增殖、迁移体外培养PASMCs,分别转染大鼠PFKFB3过表达质粒或相应的空载质粒48h,或用PFKFB3小分子抑制剂3PO处理24h后,再给予E2(10 nM)处理PASMCs 24 h,通过CCK8检测试剂盒和细胞划痕实验观察PASMCs的增殖和迁移情况。结果显示:E2可促进肺血管平滑肌细胞的增殖、迁移能力;3PO抑制PFKFB3表达后,可显著抑制E2的上述作用(n=3,P<0.01)。此外,E2(10nM)处理细胞24 h,或同时转染PFKFB3过表达质粒,与对照组相比,E2处理可促进肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移;过表达PFKFB3后,可进一步促进肺血管平滑肌细胞增殖和迁移能力(n=3,P<0.01)。3.METTL3介导E2上调肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达的作用机制3.1 E2对肺血管平滑肌细胞中PFKFB3 mRNA m6A水平的影响体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),待细胞生长至90%融合时,提取total RNAs,按Magna MeRIPTM m6AKit试剂盒说明书操作:a)细胞mRNA提取纯化。b)mRNA片段化:热循环仪94℃加热mRNA 6min,使mRNA断裂成小于200nt片段。c)免疫沉淀:1×IP缓冲液重悬Protein A/G Magnetic Beads,加入抗m6A抗体孵育弃上清,加入片段化的mRNA溶液后,孵育弃上清。d)RNA的洗脱及纯化:在上述所得的沉淀中,加入RNA洗脱液,取上清液。采用RNA纯化试剂盒纯化RNA,溶于DEPC水中。e)RT-PCR:设计引物,行RT-PCR,分析各组CT值变化。结果显示:用E2(10nM)处理后,PFKFB3 mRNA发生m6A甲基化的水平增加,增加率为(203.6±20.9)%(n=3,P<0.01)。3.2 E2上调肺血管平滑肌细胞中m6A相关蛋白METTL3表达水平体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),予以不同浓度梯度(1nM-1μM)E2处理PASMCs 24h或用相同浓度E2(10nM)处理PASMCs不同时间(1h,3h,6h,12h,24h),利用Western blot法观察E2对PASMCs中m6A主要相关蛋白(METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5)表达情况。结果显示:用不同浓度梯度的E2(1nM-1μM)处理PASMCs 24h后,METTL3蛋白表达水平均增加,增加率分别为(165.3±22.5)%(n=3,P<0.01)、(155.6±15.7)%(n=3,P<0.01)、(205.3±21.5)%(n=3,P<0.01)、(210.6±23.7)%(n=3,P<0.01);用相同浓度E2(10nM)处理不同时间(1h、3h、6h、12h,24h)后,METTL3蛋白表达水平均增加,增加率分别为(145.3±28.5)%(n=3,P<0.01)、(155.6±26.7)%(n=3,P<0.01)、(148.3±21.6)%(n=3,P<0.01)、(205.6±23.8)%(n=3,P<0.01)、(195.3±22.5)%(n=3,P<0.01),而METTL14、FTO、ALKBH5蛋白表达水平基本不变或降低。3.3 E2促进MCT诱导的PAH大鼠模型肺动脉平滑肌层METTL3表达实验方法同第一部分。结果显示:与经颈部注射生理盐水的各组大鼠相比,Western blot和RT-PCR显示假手术组+MCT组大鼠远端肺小动脉的METTL3的蛋白及 mRNA 表达明显增加,增加率分别为(205.6±23.6)%(n=6,P<0.01)、(165.6±21.9)%(n=6,P<0.01);与假手术组+MCT组比较,OVX+MCT组大鼠远端肺小动脉的 METTL3 的蛋白及 mRNA 表达明显降低,降低率分别为(175.6±20.6)%(n=6,P<0.01)、(195.6±20.8)%(n=6,P<0.01);与 OVX+MCT 组比较,补充雌激素后的OVX+MCT+E2组大鼠远端肺小动脉的METTL3的蛋白及mRNA表达则明显增加,增加率分别为(285.6±21.6)%(n=6,P<0.01)、(280.6±25.9)%(n=6,P<0.01)。3.4 METTL3介导E2上调肺血管平滑肌细胞中PFKFB3 mRNA m6A水平从体外培养的大鼠PASMCs中提取total RNAs,并按Magna MeRIPTM m6A Kit试剂盒说明书操作,通过m6ARNA甲基化免疫沉淀试剂盒检测并给予E2处理后,分析METTL3对PFKFB3 mRNA发生m6A甲基化的情况。结果显示:通过MeRIP和RT-PCR法对METTL3敲低的大鼠PASMCs中的PFKFB3 m6A水平进行了评估,证实了 PFKFB3 m6A水平的降低,降低率为(805.6±22.9)%(n=3,P<0.01),且 E2 处理后显著增加了 PFKFB3 mRNA 的 m6A 水平,增加率为(208.6±20.7)%(n=3,P<0.01)。3.5 E2通过ERα上调肺血管平滑肌细胞中METTL3蛋白表达水平体外培养 PASMCs,分别用 E2(10nM),PPT(ERα 激动剂,1nM),DPN(ERβ激动剂,1nM),MPP(ERα抑制剂,1nM),PHTPP(ERβ抑制剂,1nM)、G15(GPR30抑制剂,1nM)处理大鼠肺动脉平滑肌细胞24 h,用Western blot法检测METTL3蛋白表达情况。结果显示:E2,PPT均能上调METTL3蛋白表达,上调幅度分别为(180.3±18.9)%(n=3,P<0.01)、(240.6±20.7)%(n=3,P<0.01),而 DPN 上调作用不明显;E2上调METTL3的作用可被MPP所抑制,而不能被PHTPP和G15所抑制。由此说明,ERα参与E2上调肺血管平滑肌细胞中METTL3蛋白表达的作用。3.6 METTL3介导E2对肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达的影响体外培养PASMCs,分别转染大鼠阴性对照病毒、METTL3过表达慢病毒载体48h 或转染 METTL3 siRNA24h 后,再给予 E2(10 nM)处理 PASMCs 24h,用 Western blot法检测PFKFB3蛋白表达情况,实时RT-PCR法检测PFKFB3 mRNA表达情况。结果显示:与对照组相比,当用METTL3过表达慢病毒载体过表达METTL3时E2上调PFKFB3蛋白水平的作用增加,增加率为(250.8±22.7)%(n=3,P<0.01),基本不影响PFKFB3 mRNA的表达,而用METTL3 siRNA沉默METTL3表达时E2增加PFKFB3表达的作用被抑制,而对PFKFB3 mRNA表达亦无明显影响(n=3,P<0.01)。由此说明,E2通过METTL3上调肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达(图2-6)。3.7 E2可促进肺血管平滑肌细胞中METTL3转录活性3.3.7.1不同浓度E2处理PASMCs以及相同浓度E2(10nM)处理PASMCs不同时间,均增加METTL3 mRNA表达。体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),予以不同浓度梯度的E2处理PASMCs 24h,或用10nM浓度的E2分别处理平滑肌细胞1h,3h,6h,12h,24h后,应用实时RT-PCR法观察METTL3 mRNA表达情况。结果显示:与对照组比较,分别给予不同浓度的E2(1nM-1uM)处理PASMCs 24 h后显著增加大鼠PASMCs中METTL3 mRNA表达,增加率分别为:(235.6±24.7)%(n=3,P<0.01),(228.3±21.6)%(n=3,P<0.01),(201.6±23.8)%(n=3,P<0.01)和(195.3±22.5)%(n=3,P<0.01);以及给予 E2(10nM)处理不同时间(1h,3h,6h,12h,24h)后,大鼠PASMCs METTL3 mRNA 表达显著增加,增加率分别(185.3±26.5)%(n=3,P<0.01),(195.6±24.6)%(n=3,P<0.01),(220.3±21.8)%(n=3,P<0.01),(235.6±22.9)%(n=3,P<0.01)和(245.3±21.7)%(n=3,P<0.01)。3.3.7.2将大鼠PASMCs接种于24孔板中,生长到80%,分别在PASMCs中瞬时转染METTL3 的ERE荧光素酶质粒(METTL3-Luc,750ng)、ERE表达质粒(pLV-ERE-Luc,750ng)和空质粒 PGL3(250 ng),然后用 E2(10nM),PPT(1nM),ICI(10 nM)处理细胞24h,检测对应的发光单元荧光值。结果显示:E2,PPT能显著增加METTL3转录活性,增加率分别为(285.6±21.7)%(n=3,P<0.01)、(268.6±23.8)%(n=3,P<0.01),这一作用可被 ICI 逆转(图 2-6)。3.8抑制METTL3表达对E2促进肺血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响体外培养PASMCs,分别转染大鼠METTL3 siRNA或对应的Scrambled siRNA后,给予E2(10nM)处理PASMCs 24h,通过CCK8检测试剂盒和细胞划痕实验观察PASMCs的增殖和迁移情况。结果显示:与对照组相比,转染Scrambled siRNA施加E2处理可促进PASMCs的增殖和迁移,而转染了 METTL3 siRNA后,显著抑制了 E2处理后促进PASMCs增殖和迁移的效应(n=3,P<0.01)。3.9抑制METTL3表达,同时过表达PFKFB3对E2促进肺血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响体外培养PASMCs,分别转染大鼠METTL3 siRNA或转染大鼠METTL3 siRNA的同时转染PFKFB3过表达质粒后,给予E2(10 nM)处理细胞24 h,通过CCK8检测试剂盒和细胞划痕实验观察PASMCs的增殖和迁移情况。结果显示:与对照组相比,转染Scrambled siRNA施加E2处理可促进PASMCs的增殖和迁移,而转染了 METTL3 siRNA后,显著抑制E2促进PASMCs增殖和迁移的效应。回补PFKFB3蛋白后,细胞增殖、迁移能力增强(n=3,P<0.01)。[结论]一方面,E2可促进MCT诱导的肺动脉高压的发展;另一方面,E2通过上调METTL3水平,促进PFKFB3 mRNA m6A甲基化水平,促进PFKFB3蛋白的表达,最终促进平滑肌细胞的增殖、迁移能力。