冠状动脉微循环障碍(coronary microvascular dysfunction,CMD)通常是指发生于直径小于300μm心脏血管的结构和功能改变。现代医学的经皮冠状动脉介入术治疗并不能使CMD患者受益,而且尚无明确可以治疗CMD的药物,因此寻找适合治疗CMD的方案成为新的研究热点。目前,冠脉微循环障碍动物模型多使用大动物,在心血管介入的条件下冠脉内注射栓塞剂,其实验条件和成本均较高。在大鼠冠脉微循环障碍模型应用的报道中,栓塞剂的选择与模型的建立情况并没有进行仔细研究,建立的标准还有待确定和统一。为了进行规范的药物作用机制研究,大鼠冠状动脉微循环障碍动物模型的方法学研究亟待开展。双参宁心胶囊是由人参、丹参和元胡药味中所含治疗缺血性心脏病有效部位及成分组成,具有益气活血、祛瘀止痛之功效,用于冠心病、心绞痛、冠脉微循环障碍气虚血瘀证。前期研究显示,双参宁心胶囊对于治疗缺血性心脏病具有很好的治疗作用,但双参宁心胶囊对冠脉微循环障碍的作用效果及其机制仍知之甚少。本研究首先探索了不同栓塞剂建立的大鼠冠脉微循环障碍模型,在此基础上开展了双参宁心胶囊的治疗作用研究,通过网络药理学预测双参宁心胶囊入血成分对冠脉微循环障碍的可能机制,并对其提示的血管舒张作用进行了验证研究。本研究分为四个部分:一、大鼠冠脉微循环障碍模型制备方法探索1.1化学损伤内皮法与微球栓塞法制备大鼠冠脉微循环障碍模型比较研究目的探索化学性损伤和微球机械栓塞法建立大鼠微循环障碍模型差异。方法SD大鼠随机分为假手术组、月桂酸钠组和微球栓塞组。动物麻醉下开胸,向左心室注射栓塞微球(直径42～10μm或1g/L月桂酸钠。术后24h处死动物前测定血流动力学指标、超声心动图测定心功能、血清CK、CK-MB和LDH活性、心肌组织进行HE染色。结果月桂酸钠组与假手术组LV+dp/dtmax未见明显差异,微球栓塞组明显降低;微球栓塞组动物超声心动图EF值降低约30%,FS降低约23%;微球栓塞组可以显著升高CK-MB与LDH活性;HE染色月桂酸钠组可见心肌内微血栓形成,微球栓塞组可见微血管内栓塞微球,两组均存在心肌细胞溶解、断裂、中性粒细胞浸润。小结心室内注射月桂酸钠及栓塞微球两种造模方法均可以造成冠脉微循环障碍,对大鼠心脏功能有一定影响。微球机械栓塞较化学损伤内皮法模型更加明显和稳定,24h可见明显血流动力学及心功能降低,心肌酶升高。40～120μm栓塞微球心室注射法建立大鼠冠脉微循环障碍模型更适合药理研究用。1.2不同直径微球栓塞制备大鼠冠脉微循环障碍模型比较研究目的探索不同直径栓塞微球经心室内注射建立大鼠微循环障碍模型差异。方法SD大鼠随机分为假手术组,45～53μm、40～120μm、106～125μm微球组。向左心室注射不同直径的栓塞微球。术后24h处死动物前测定血流动力学指标、超声心动图测定心功能、心肌组大体形态拍照和TTC染色。结果与假手术比较,45-53μm、40-120μm和106-125μm微球组超声心动图EF值降低约8～20%,FS降低11～22%;40～12μm、106～125μm微球组还可降低SBP、DBP和MAP;三种直径微球均可降低LVSP;45-53μm、40-120μm和106-125μm微球组LV+dp/dtmax分别降低了 25%、27%和30%;三种直径微球还均可降低LV-dp/dtmax;大鼠心脏切片TTC染色,45-53μm微球组仅有十分少量的微梗死区域,而40-120μm微球组可见较多散在的梗死区域,106-125μm微球组微梗死区域大面积融合,几乎遍布左心室与右心室。小结三种直径微球均可以造成不同程度冠脉微循环障碍。45-53μm微球造模相对较轻,而106-125μm微球对大鼠损伤过于严重,40-120μm微球对大鼠心脏功能有较明显影响,同时可以显示出适当的微梗死面积,比较适合开展进一步机制和药物干预研究。二、双参宁心胶囊对大鼠冠脉微循环障碍的干预作用2.1双参宁心胶囊对大鼠冠脉微循环障碍心脏及其功能影响目的研究双参宁心胶囊对冠脉微循环障碍大鼠心脏及其功能的影响方法SD大鼠随机分组:假手术组,模型组,尼可地尔片组,通心络胶囊组,双参宁心180、90、45mg/kg组。先给予相应药物灌胃给药7d,末次给药后2h进行模型制备。向左心室注射栓塞微球(直径42～120μm),术后24h处死动物前测定血流动力学指标、超声心动图测定心功能、血清生物标志物、血清血管内皮功能指标、Western bolt检测心肌组织凋亡与炎症相关蛋白表达、心肌TTC染色测定梗死面积,HE和Heidenhain染色观察病理改变,透射电镜观察心肌组织超微结构。结果双参宁心胶囊可以增加EF约13～20%,增加FS约10～18%,还可以明显降低 LVIDs、LVESV,增加 LVEDV、SV 和 CO;升高 SBP、DBP 及 MAP,以增加 LVSP 约 14～18%,增加 LV+dp/dtmax 24～30%,增加 LV-dp/dtmax 28～31%;降低动物血清CK、LDH、CK-MB及cTnT的作用;降低血清ET-1、AngⅡ和升高NO水平的作用;降低大鼠心肌Caspase-3蛋白表达,升高大鼠心肌Bcl-2表达;减小心肌梗死面积约40～50%;减轻心肌病理组织学改变,减少Heidenhain黑染心肌细胞数量及弥漫性,改善心肌超微结构改变。小结双参宁心胶囊可以明显改善冠脉微循环障碍大鼠血流动力学、心功能,减少心肌梗死面积,减少心肌损伤标志物增加,还可以升高血清NO、降低ET-1和AngⅡ水平,可以通过抑制心肌细胞凋亡起到保护心肌的作用。2.2双参宁心胶囊对大鼠冠脉微循环障碍心肌血流灌注的影响目的研究双参宁心胶囊对冠脉微循环障碍大鼠心肌微血管灌注的影响方法SD大鼠随机分组:假手术组,模型组,双参宁心90mg/kg组。造模给药方法同前,术后24h行心肌声学造影,15μm荧光微球测定局部血流灌注。结果较模型组,反应局部心肌血容量的A值双参宁心胶囊升高了约38%,反应心肌血流速度的β值升高了约46%,反应心肌血流量Aβ值升高了约93%;荧光微球测得的心肌局部血流较模型组升高了约35%。结论双参宁心胶囊可以明显改善冠脉微循环障碍大鼠改善血流灌注情况、增加微血管密度、增加心肌局部血流量。三、基于衍射增强成像的大鼠冠脉微循环障碍可视化研究3.1冠脉微循环障碍大鼠冠脉微血管铸型研究目的研究冠脉微循环障碍大鼠冠脉血管铸型及双参宁心胶囊干预后血管变化方法SD大鼠随机分组:假手术组,模型组,双参宁心90mg/kg组。造模给药方法同第二部分,术后24h处死动物前心脏冠脉血管铸型。结果建立了大鼠冠脉血管铸型方法,血管分辨率可达40μm。模型组较假手术组冠脉微血管密度明显降低,双参宁心胶囊干预后可以增加冠脉微血管密度。小结冠脉血管铸型可以反映出冠脉微循环障碍大鼠血管异常,双参宁心胶囊可以明显改善冠脉微循环障碍大鼠冠脉微血管密度降低。3.2冠脉微循环障碍大鼠衍射成像可视化研究目的探索X线衍射增强成像技术在冠脉微循环障碍大鼠冠脉血管可视化应用及双参宁心胶囊干预后血管变化方法SD大鼠随机分组:假手术组,模型组,双参宁心90mg/kg组造模给药方法同第二部分,大鼠心脏取材后多聚甲醛固定,在北京同步辐射装置4W1A成像实验站采集DEI峰位图,使用Avizo9.0软件对处理后的断层图进行三维重建,观察冠脉微血管走形及空间形态结构。结果建立了在大鼠冠脉微循环障碍大鼠冠脉X线衍射增强成像的采集条件,血管分辨率可达10μm级别。模型组较假手术组冠脉微血管密度明显降低,双参宁心胶囊干预后可以增加冠脉微血管密度。小结利用X射线衍射增强成像技术可以比较清楚地观察到大鼠冠脉微血管,并且能够在一定程度上构建出血管网的三维可视化模型。冠脉微栓塞所致冠脉微血管功能障碍大鼠冠脉微血管存在的异常可以被该方法检测,同时双参宁心胶囊增加冠脉微血管密度的作用亦可以被该方法体现。四、基于网络药理学预测的双参宁心胶囊干预冠脉微循环障碍机制研究4.1基于网络药理学方法预测双参宁心胶囊治疗冠脉微循环障碍作用目的通过网络药理学技术探索双参宁心胶囊治疗冠脉微循环障碍的潜在靶点和机制。方法根据前期双参宁心胶囊大鼠体内药代动力学研究结果,选择检测到的29种入血成分,通过SEA数据库、STITCH数据库和Swiss TargetPrediction平台预测双参宁心胶囊治疗冠脉微循环障碍的作用靶点。结果双参宁心胶囊可能通过药物的反应、正向调节蛋白质磷酸化、钙介导的信号调节、腺苷酸环化酶激活的肾上腺素能受体、一氧化氮合成等生物过程发挥治疗冠脉微循环障碍作用;其作用机制可能与调节钙离子信号通路、血管平滑肌收缩、cAMP信号通路、心肌肾上腺素能信号通路有关。小结双参宁心胶囊入血成分通过多靶点,多通路的协同方式在干预冠脉微循环障碍发挥作用,其中对于血管平滑肌的收缩调控可能是关键机制之一。4.2双参宁心胶囊对大鼠动脉血管环舒张作用研究目的验证网络药理学预测结果,探索双参宁心胶囊舒张血管机制。方法采用SD大鼠离体胸主动脉环,观察双参宁心胶囊提取物对内皮完整及去内皮血管环氯化钾(KCl)和去甲肾上腺素(NE)预收缩血管环的作用;分别给予一氧化氮合酶抑制剂L-NAME、鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ、环氧合酶抑制剂吲哚美辛(Indo)、电压依赖型钾通道阻滞剂4-氨基吡啶(4-AP)、钙激活的钾通道阻滞剂氯化四乙胺(TEA)、ATP敏感型钾通道阻滞剂格列苯脲(Gli)、内向整流型钾通道阻滞剂氯化钡(Bacl2)、β受体阻滞剂普萘洛尔(Prop)等处理血管环,观察双参宁心胶囊影响血管环张力的机制;用无钙K-H液处理,观察双参宁心胶囊对动脉环内钙释放与外钙内流的影响。结果双参宁心提取物对KCl和NE预收缩血管环张力呈时间依赖、剂量依赖性舒张作用;当去除血管内皮时,其舒张血管的作用受到一定抑制,L-NAME和ODQ处理血管环舒张作用也受到一定抑制,Indo和Prop处理组与未处理组未见差异;TEA和Bacl2处理血管环舒张作用受到一定抑制,Gli和4-AP处理组与未处理组未见差异;双参宁心提取物对内钙释放与外钙内流均有抑制作用。小结双参宁心胶囊提取物既可抑制动脉平滑肌细胞膜电压依赖性和受体操纵性引起的外钙内流,也可抑制受体操纵性细胞内钙释放;还可以通过内皮依赖的eNOS-NO-cGMP舒张途径发挥舒张血管的作用;同时,还可以通过开放平滑肌钙激活钾通道和内向整流钾通道来实现血管舒张调节。这些作用机制与网络药理学预测结果有较好的一致性。结论直径40～120μm栓塞微球建立的CMD模型具有稳定、损伤程度适当的特点,可用于CMD发病机制和治疗干预研究。冠脉血管铸型模型和X-衍射增强成像可以用于评价CMD微血管的空间形态改变,X-衍射增强成像分辨率可接近毛细血管水平。双参宁心胶囊可以改善CMD血管内皮功能,调节血管舒缩,改善心肌血流灌注,减少心肌坏死和凋亡,增加心脏收缩和舒张功能。