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神经胶质瘤简称胶质瘤,是神经外科常见的原发性颅内肿瘤,同时也是治疗难度最大的疾病之一。胶质瘤具有恶性程度高、侵略性极强以及易复发等特点,而其本质上是一种多基因异常的疾病,通过过表达原癌基因,伴随抑癌基因的突变、缺失,使得肿瘤细胞逃避了细胞的正常生存机制。直至目前为止,临床上采用手术、物理放射性治疗以及联合药物化疗等方法治疗恶性胶质瘤,尽管上述治疗方法都有了很大的进步,但患者的预后仍然不理想。随着对神经胶质瘤的基础研究不断推进,大量研究已揭示了神经胶质瘤的生物学机制以及胶质瘤干细胞的存在,并对同一病人的肿瘤或不同患者的相同类型肿瘤进行了分子异质性的描述。因此,在肿瘤细胞分子水平,针对其分子病理机制进行研究,从肿瘤发生发展的过程寻找突破点,是开发出更有效、更精准、更快捷的肿瘤治疗方案的关键所在。miRNAs是非编码RNA家族中的一种,具有18-25个核苷酸,在转录后水平进行基因调控。研究已确认miRNAs在神经胶质瘤的发生发展中扮演重要角色,调控着许多与肿瘤发病相关的信号通路,并在恶性胶质瘤的进展、细胞侵袭、肿瘤生长和治疗反应中发挥重要作用。Micro RNA-320a(miR-320a)位于染色体8p21.3,在肝癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤中均异常低表达,并且研究已表明其具有多种细胞生物作用,如调节细胞增殖、分化及迁移侵袭等。miR-320a在肿瘤中具有多个靶点基因,也相继得到了实验验证,而在胶质瘤中的作用和功能仍需要进一步的探索和发现。水通道蛋白4(AQP-4)是水通道蛋白家族中的一员,具有在脑组织中特别富集的特点,并在不同的结构区域发挥不同的功能。最初AQP-4被定义为一种纯粹的水分子运送蛋白,在脑组织中参与了组织水肿、细胞水的调节及脑脊液的形成。然而,AQP-4的细胞生物学功能不仅如此,它还能富集在胶质细胞终足上,参与细胞膜的解离与重组,在细胞延伸与运动中发挥关键作用。值得注意的是,基质金属蛋白酶9(MMP-9)同样具有促进细胞侵袭和迁移的功能。因此,我们提出假设:miR-320a是否能调节胶质瘤细胞的侵袭和迁移,以及AQP-4、MMP-9在此过程中发挥什么作用?目的本研究以人神经胶质细胞瘤U87、U251细胞株为研究对象,观察miR-320a对细胞侵袭迁移的影响。以生物信息学分析为基础,探讨miR-320a的作用机制,以及AQP-4、MMP-9在此过程中发挥的作用。通过实验分析,为临床治疗神经胶质瘤提供更多的理论依据和药物靶点参考。方法生物信息学分析CGGA(Chinese Glioma Genome Atlas)数据库,分析miR-320a在高级别和低级别神经胶质瘤的表达差异以及高低表达miR-320a的总生存率的差异;用miRBase、Targetscan和micro RNA.org进行miR-320a靶点预测,分析出miR-320a在AQP-4 m RNA 3’-UTR结合区域,化学合成序列、构建质粒进行双荧光素酶报告基因验证;脑胶质瘤组织切片免疫组织化学染色鉴定AQP-4的表达水平;体外培养人神经胶质瘤细胞株U87、U251,分别进行miR-320a及miRNA negative control(miR-NC)mimics转染,48小时后q PCR检测转染效率,Transwell实验分析细胞迁移侵袭能力,q PCR和Western Blot检测AQP-4及MMP-9 m RNA和蛋白水平的表达情况、免疫荧光检测AQP-4蛋白表达情况;对AQP-4基因进行干扰,q PCR和Western Blot检测AQP-4基因干扰后m RNA和蛋白表达水平,Transwell实验分析基因干扰后侵袭和迁移能力。结果1.CGGA数据分析结果显示:miR-320a在WHOⅣ和Ⅲ级胶质瘤中的表达水平明显低于WHOⅡ级胶质瘤,并且高表达miR-320a组的总生存率也明显高于低表达miR-320a组。2.预测靶点分析:AQP-4 m RNA 3’-UTR 2000 bp内有3个miR-320a结合靶点。经过双荧光素酶报告基因的分析验证,其中848-870 bp区域为miR-320a的有效结合区域。3.临床标本组织切片分析:对正常脑组织及WHOⅡ和WHOⅣ胶质瘤组织进行HE和IHC染色分析。HE染色结果显示:与正常脑组织相比较,Ⅳ级肿瘤组织中肿瘤细胞异型性明显,有瘤巨细胞形成、核大小不一、染色质丰富,有核分裂象。IHC结果显示,AQP-4在胶质瘤组织中高表达和极性分布,且与肿瘤WHO分级呈正比。4.miR-320a过表达转染实验:U87和U251细胞株分别转染miR-320a和miR-NC mimics,q PCR结果显示:与miR-NC和空白对照组相比miR-320a mimic组中miR-320a的表达量显著增高,而miR-NC组与空白对照组无明显差异。Transwell功能实验分析结果显示:过表达miR-320a后能明显抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。5.q PCR和WB结果显示:过表达miR-320a能显著降低AQP-4m RNA和蛋白水平的表达,MMP-9的表达则无明显变化。6.q PCR和WB结果显示:AQP-4 si RNA转染后能显著降低AQP-4 m RNA和蛋白水平的表达,Transwell功能实验显示干扰AQP-4的表达能显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。7.免疫荧光结果显示:过表达miR-320a和干扰AQP-4后能明显降低肿瘤细胞AQP-4蛋白的表达。结论1.miR-320a在神经胶质瘤中异常低表达,并且与临床预后相关。2.抑制AQP-4的表达能有效抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。3.miR-320a直接靶向作用AQP-4 m RNA 3’-UTR,抑制其蛋白的表达,并发挥抑制胶质瘤细胞迁移侵袭的作用。