背景与目的　　河南是中国乃至世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区，河南食管癌以食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）为主（占90%以上），化疗在ESCC的综合治疗中占据重要地位，但由于肿瘤细胞易对化疗药物产生耐受性，尤其是发生转移的肿瘤细胞耐受性更强，而且化疗耐药的肿瘤也易发生远处转移，最终导致治疗失败。对化疗耐受的病人，通常表现为对多种在结构和功能上不同的细胞毒性药物的抗性，即多药物耐药（multi-drug resistance，MDR）。MDR 涉及到多种机制，如细胞表面耐药蛋白表达升高，药物外排增多，促癌基因被激活，细胞凋亡通路受到阻滞等。然而，由于肿瘤耐药机制异常复杂，MDR发生的信号传导调控网络仍未完全阐明，所以仍然需要不断探索新的肿瘤耐药机制从而提高化疗疗效。因此研究与 ESCC 耐药有关的基因或分子具有十分重要的理论和临床意义。　　Bit1（Bcl-2 inhibitor of transcription 1）是一种肽酰-tRNA水解酶，最先的研究认为Bit1介导了整合素依赖的失巢凋亡，也可通过ErK信号通路介导细胞凋亡。后来，有研究认为Bit1通过激活NF-κB信号通路，介导了整合素依赖的细胞存活，还有研究显示Bit1可以激活ErK信号，增强细胞抗凋亡能力。目前，只有极少量文献报道 Bit1 与肿瘤的关系，其中多数认为其表达可抑制肿瘤的转移，如在晚期乳腺癌组织中Bit1表达下调并促进细胞的转移，在肺癌中Bit1通过抑制上皮细胞-间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）而抑制转移。而本课题组前期研究表明，Bit1在伴淋巴结转移的ESCC中过表达且与Bcl-2表达呈正相关关系，Bit1表达下调可诱导ESCC细胞凋亡，抑制其增殖、迁移和侵袭能力，并明显抑制裸鼠ESCC移植瘤的生长，在ESCC细胞中Bit1和黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）可形成复合物，基因芯片表达谱中桩蛋白和ABCB1（编码P-gp蛋白）mRNA信号值随着Bit1表达下调而减弱。由此可见，Bit1 在细胞凋亡及肿瘤转移中均发挥着双向调节作用。至于Bit1 与肿瘤化疗敏感性的关系，国内外未见报道。　　为了进一步探讨Bit1和ESCC细胞耐药之间的关系及分子机制，本实验通过（1）Bit1表达水平不同的ESCC细胞生物学特性及化疗敏感性差异的比较；（2）ESCC耐药细胞株EC1/PTX的建立并鉴定；（3）耐药细胞株EC1/PTX建立过程中Bit1及相关蛋白表达水平的动态变化；（4）Bit1-siRNA下调耐药细胞株中Bit1 蛋白表达后细胞凋亡以及相关蛋白的表达变化等四个部分来研究 Bit1在食管鳞癌细胞耐药中的作用及其分子机制，以期可以为 Bit1 过表达可促进食管鳞癌发生耐药提供佐证，同时也为发现食管鳞癌临床转移及其预后评价的分子标志物提供新思路。　　方法　　1 Bit1表达水平不同的ESCC细胞生物学特性及化疗敏感性差异的比较。　　分别采用CCK-8、划痕和Transwell实验检测EC1细胞（Bit1高表达）和TE1细胞（Bit1低表达）的增殖、迁移和侵袭能力，比较其差异；CCK-8法检测化疗药物紫杉醇（PTX）和顺铂（CDDP）在EC1和TE1细胞中的IC50值。　　2 ESCC耐药细胞株EC1/PTX的建立并鉴定。　　采用高剂量紫杉醇冲击诱导结合时间递增的方法加药诱导 EC1 细胞；观察耐药细胞EC1/PTX与亲本细胞EC1形态学差异；绘制生长曲线，计算倍增时间；CCK-8法检测两种细胞的IC50值并计算耐药指数；Transwell实验对比两种细胞迁移能力及侵袭能力差异；流式细胞术检测两种细胞的周期及凋亡差异；平板克隆形成实验对比两种细胞的集落形成能力；Western blot检测耐药蛋白P-gp、MRP、BCRP以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达变化。　　3Western blot检测耐药细胞株EC1/PTX建立过程中Bit1、FAK、p-FAK蛋白表达水平的动态变化。　　检测耐药细胞EC1/PTX中Bit1、FAK、p-FAK蛋白的表达变化；检测耐药细胞建立过程中Bit1、FAK、p-FAK蛋白表达的动态变化并与耐药蛋白P-gp表 达变化的关系。　　4 Bit1-siRNA下调耐药细胞EC1/PTX中Bit1表达。　　流式细胞术检测细胞凋亡变化；Western blot检测耐药蛋白P-gp、MRP、BCRP的表达变化并与Bit1表达变化的关系以及FAK、p-FAK蛋白的表达变化并与耐药蛋白表达变化的关系。　　结果　　1 ESCC细胞株EC1（Bit1高表达）的增殖、迁移和侵袭能力明显强于TE1 （Bit1低表达）（均P＜0.05），化疗药物紫杉醇（PTX）和顺铂（CDDP）在EC1和 TE1 细胞中的IC50 值分别为 0.033±0.001μg/mL、0.745±0.153μg/mL 和0.004±0.001μg/mL、0.274±0.032μg/mL，前者分别是后者的8.25倍和2.72倍。　　2 建立并鉴定耐药细胞株 EC1/PTX：（1 ）成功建立 ESCC 耐药细胞株EC1/PTX；（2）与亲本细胞EC1相比，耐药细胞EC1/PTX形态变长，并常呈现聚团生长状态；（3）亲本细胞 EC1 增殖速度高于耐药细胞 EC1/PTX，并在 96小时后表现出明显差异，耐药细胞EC1/PTX倍增时间延长（P＜0.05）；（4）耐药细胞株EC1/PTX对多种化疗药物均具有不同程度的耐药，即多药耐药，其中对紫杉醇耐药程度最高，耐药指数为12.818（均P＜0.05）；（5）耐药细胞EC1/PTX的迁移能力和侵袭能力均强于亲本细胞EC1（均P＜0.05）；（6）与亲本细胞EC1相比，耐药细胞EC1/PTX 凋亡率明显降低，周期在 G0/G1期、S 期分布增多，G2/M期分布下降（均P＜0.05）；（7）耐药细胞EC1/PTX的单个细胞增殖能力、克隆形成率明显低于亲本细胞 EC1（P＜0.001）；（8）与亲本细胞 EC1 相比，EC1/PTX细胞中耐药蛋白P-gp、MRP以及BCRP蛋白表达明显升高，促凋亡蛋白Bax表达明显下降，Bcl-2蛋白表达明显上升（均P＜0.05）。　　3Western blot检测在耐药细胞株EC1/PTX建立过程中Bit1及相关蛋白表达水平的动态变化：（1）在最终建立的耐药细胞株EC1/PTX细胞中Bit1表达明显升高，同时FAK、p-FAK蛋白表达量也达最高（均P＜0.01）；（2）在耐药细胞建立过程中，Bit1、FAK、p-FAK蛋白表达呈现出逐渐上升的趋势，并与耐药蛋白P-gp的表达变化呈正相关（均P＜0.05）。　　4 用Bit1-siRNA下调耐药细胞EC1/PTX中Bit1蛋白表达后：（1）细胞凋亡率升高；（2）耐药蛋白P-gp、MRP以及BCRP的蛋白表达随之下降并与Bit1 表达变化呈正相关（均P＜0.05）；（3）FAK、p-FAK蛋白的表达也同时随之下降并与耐药蛋白P-gp的表达变化呈正相关（均P＜0.05）。　　结论　　1 Bit1可能参与了食管鳞癌细胞耐药发生过程，其高表达可促进食管鳞癌细胞对化疗药物产生耐药性，而下调其表达可逆转其过程。　　2 FAK可能作为Bit1下游效应分子被激活，从而促进食管鳞癌耐药过程的发生。