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原发性肝癌是现今人类最为常见恶性肿瘤之一,目前临床上最为常见的是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。肝移植和肝切除术是肝细胞癌的主要治疗手段,但效果仍然不佳。因此,深入研究HCC发生发展的分子机制,寻求HCC早期诊断或精准治疗的靶标至关重要。越来越多的研究表明,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在肿瘤的发生发展中有着重要的作用,现有研究证明MIR31HG在多种癌症中均存在着异常表达并发挥着重要的调控作用,但其在HCC中的表达及作用机制尚未知。因此,本研究旨在探究MIR31HG在人HCC组织的表达情况及与临床相关指标的联系,揭示其在HCC中的诊断和治疗中的潜在意义;采用体外细胞实验,探讨MIR31HG对肝癌细胞系的生物学功能的影响,并研究其具体的分子作用机制;最后通过体内实验进一步验证MIR31HG在HCC中的功能及其分子作用机制。本研究主要分为以下三个部分:第一部分MIR31HG在人肝癌细胞系及肝癌组织样本中的表达及其对肝癌细胞生物学功能的影响目的:检测lncRNA-MIR31HG在肝癌细胞及HCC组织标本中的的表达,并研究其与HCC患者临床病理特征的关系,从而证明MIR31HG对肝癌细胞生物学功能的存在影响作用。方法:1.采用实时定量荧光PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术检测MIR31HG在人正常肝细胞系和肝癌细胞系、HCC组织与癌旁组织的表达差异。2.统计分析42例HCC患者的临床病理学资料与患者HCC组织中MIR31HG表达水平的关系。3.采用RNA核质分离技术检测MIR31HG在肝癌细胞中的定位情况。4.采用MTS法以及克隆形成实验检测MIR31HG过表达或干扰后对肝癌细胞增殖的影响,采用划痕实验以及Transwell小室实验分别检测迁移和侵袭能力。结果:1.MIR31HG在人肝癌细胞系及HCC组织中呈现为低表达。2.在HCC组织中,MIR31HG的表达与肿瘤大小(P=0.0268)、肿瘤结节数(P=0.0477)、血管侵犯(P=0.0332)及TNM分期(P=0.0308)有关,而与病人年龄、性别、乙肝表面抗原等无关(P>0.05)。3.MIR31HG的表达主要在肝癌细胞的细胞质中。4.过表达MIR31HG抑制肝癌细胞的增殖和迁移、侵袭功能,而干扰MIR31HG促进其增殖和迁移、侵袭功能。结论:MIR31HG在人肝癌细胞系及HCC组织中均呈现为低表达,而在低表达的HCC患者中预示更差的临床预后,且MIR31HG可抑制肝癌细胞增殖和转移的能力。第二部分MIR31HG对肝癌细胞生物学功能影响的机制研究目的:深入研究MIR31HG影响肝癌细胞生物学功能的分子机制。方法:1.生物信息学分析可能与MIR31HG结合的短链非编码RNA(microRNA,miRNA)。2.采用qRT-PCR检测MIR31HG过表达或干扰后肝癌细胞中miR-575的表达水平的变化情况,及miR-575过表达或干扰后肝癌细胞中MIR31HG的表达水平。3.荧光素酶报告基因实验检测MIR31HG与miR-575的结合情况。4.采用RIP实验进一步检测MIR31HG与miR-575的相关性。5.采用qRT-PCR技术检测miR-575在人正常肝细胞系和肝癌细胞系、人肝癌组织与癌旁组织的表达差异,以及MIR31HG与miR-575在HCC组织上表达的相关性。6.采用MTS法和克隆形成实验检测miR-575过表达或干扰后对肝癌细胞增殖的影响,采用划痕实验、Transwell小室实验分别检测miR-575过表达或干扰后对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。7.生物信息学分析可能与miRNA结合的靶基因。8.采用qRT-PCR及western blot法检测MIR31HG过表达或干扰后及miR-575过表达或干扰后肝癌细胞中ST7L的表达水平的变化情况。9.荧光素酶报告基因实验检测miR-575与ST7L 3’UTR的结合情况。10.采用qRT-PCR及western blot法检测ST7L在人正常肝细胞系和肝癌细胞系、人HCC组织与癌旁组织的表达差异,以及MIR31HG与ST7L及miR-575与ST7L在HCC组织上表达的相关性。11.采用MTS法以及克隆形成实验检测MIR31HG和miR-575过表达和干扰质粒共转染后对肝癌细胞增殖的影响,采用划痕实验以及Transwell小室实验分别检测共转染后对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。12.采用qRT-PCR及western blot法检测MIR31HG和miR-575过表达和干扰质粒共转染后ST7L的表达水平的变化情况。结果:1.生物信息学预测到10个miRNAs,其中miR-575在MIR31HG过表达后下调最为显著。2.MIR31HG与miR-575可以相互负调控其表达。3.荧光素酶实验提示MIR31HG可直接调控miR-575。4.RIP实验结果表明Ago2抗体组沉淀下来的MIR31HG的量明显高于IgG对照组,进一步证明MIR31HG可直接靶向结合miR-575。5.MiR-575在肝癌细胞系和HCC组织中表达上调,并与MIR31HG在HCC组织中的表达呈负相关。6.过表达miR-575促进肝癌细胞的增殖和迁移、侵袭功能,干扰miR-575抑制其增殖和迁移、侵袭功能。7.生物信息学预测到8个miR-575的靶基因,其中ST7L在MIR31HG过表达后上调最为显著。8.QRT-PCR和western blot检测发现MIR31HG可正调控ST7L的表达,而miR-575可负调控ST7L的表达。9.荧光素酶实验证实ST7L是miR-575下游的靶基因。10.ST7L在肝癌细胞系和HCC组织中表达上调,且与MIR31HG在组织中的表达呈正相关,与miR-575在组织中的表达呈负相关。11.pcDNA3.1-MIR31HG可拮抗pre-miR-575的促进肝癌细胞增殖和迁移、侵袭作用,并增强anti-miR-575的抑制肝癌细胞增殖和迁移、侵袭作用;而sh-MIR31HG表现出相反的结果。12.pcDNA3.1-MIR31HG可拮抗pre-miR-575对ST7L的抑制作用,并增强anti-miR-575对ST7L的促进作用;而sh-MIR31HG表现出相反的结果。结论:MIR31HG可作为miR-575的分子海绵,下调miR-575的表达,并通过miR-575上调ST7L的表达,从而抑制肝癌细胞的增殖和转移。第三部分裸鼠体内验证MIR31HG对肝癌细胞增殖和转移的影响目的:进一步体内活体实验验证MIR31HG对肝癌细胞生物学功能的影响及作用机制。方法:1.构建裸鼠的皮下成瘤及肺转移模型,进行皮下或者肝脏注射MIR31HG过表达及干扰的稳定肝癌细胞系。2.每周记录皮下瘤体积及重量变化,35天后处死裸鼠后采用qRT-PCR、western blot法及免疫组化检测miR-575、ST7L和Ki-67的表达量。3.56天后处死转移组裸鼠,获其肝和肺组织后,计数其表面结节数,并进行HE染色分析。结果:1.皮下瘤实验组结果表明,MIR31HG过表达组与正常对照组相比,其肿瘤体积和重量明显较小,且MIR31HG过表达组的成瘤中miR-575和Ki-67的表达显著下调,而ST7L的表达显著上调;MIR31HG干扰组则表现出相反的实验结果。2.肝肺转移实验组表明MIR31HG过表达组与正常对照组相比,其肝肺转移病灶明显较对照组少;MIR31HG干扰组则表现出相反的实验结果。结论:MIR31HG在活体实验中可明显抑制肝癌细胞的生长和转移,验证了MIR31HG可以作为miR-575的分子海绵而干扰miR-575表达并转录后上调ST7L的表达,该实验结果为针对MIR31HG的HCC靶向治疗提供了一定的理论依据。