论文部分内容阅读
目的:刚地弓形虫(Toxoplasma gondii,T.gondii)是一种重要的机会致病性原虫。该虫呈世界性分布,引起的弓形虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,免疫功能正常的个体感染弓形虫通常无症状并可能终身处于隐性感染状态。NKG2D是一种主要表达在NK及各类T细胞上的活化型受体,能够识别并结合受到应激后细胞表面表达的多种配体,并促进机体内各类免疫细胞分泌多种细胞因子。小鼠体内的可溶性MULT1(sMULT1)配体可以促进NK细胞表面NKG2D的表达,提高机体中NK细胞对肿瘤的免疫杀伤效应。sMULT1在抗弓形虫感染免疫调控中的作用尚未见报道,本研究拟通过在小鼠体内过表达sMULT1,研究NKG2D途径对弓形虫感染小鼠免疫应答的影响。 方法:8周龄雌性BALB/c小鼠经腹腔感染50个RH株弓形虫速殖子1w后流式细胞检测分析感染小鼠脾脏主要免疫细胞亚群的比例及增殖相关分子的表达。分别于感染前1天及感染后第2和第5天经尾静脉高压注射表达sMULT1的质粒pEGFP-N1-sMULT1(1.5ml,40μg/只),观察过表达sMULT1对感染弓形虫小鼠生存时间、原虫虫荷及肝脏病变的影响。另外,也观察了过表达对感染小鼠脾细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和NKT细胞的百分比及CX5、CD69、KLRG1、CD27表达的影响及对各亚群细胞IL-4、IL-10、IFN-γ分泌或转录因子Foxp3及Ki67的表达变化。 结果:弓形虫感染1w后脾脏CD8+T细胞比例显著升高,CD8+T细胞表面NKG2D、CD69、CD27的表达上调;CD4+T细胞的比例变化不明显,但其CD69表达升高,而NKG2D和KLRG1表达下降。感染1w后小鼠脾脏中NK及NKT细胞比例下降,但NK细胞表面NKG2D、CD69和CD27的表达明显升高,且NK及NKT分泌高水平的IFN-γ。另外,感染1w后脾脏CD4+T、CD8+T细胞的Foxp3表达无明显变化,虽然流式分析发现CD4+Foxp3+及CD8+Foxp3+细胞群中Ki67的比例升高。 在T.gondii感染的同时给予了表达sMULT1的质粒DNA干预后发现,过表达sMULT1可使弓形虫感染小鼠脾脏CD8+T和CD4+T细胞比例进一步升高;虽对脾脏NK和NKT细胞的比例影响不大,但能促进NK细胞表面NKG2D的表达,而对CD8+T细胞、CD4+T细胞及NKT细胞的NKG2D表达无影响。另外,观察了过表达sMULT1对弓形虫感染小鼠脾脏主要免疫细胞亚群活化的影响,结果发现sMULT1过表达并不进一步促进NK及NKT细胞表面CD69、CD27或抑制性受体KLRG1的表达,但可促使CD8+T及CD4+T细胞表面CD69、CD27表达升高,而KLRG1表达降低。sMULT促进小鼠免疫杀伤功能增强的同时,CD4+Foxp3+Tregs及CD8+Foxp3+Tregs亚群细胞的增殖潜能明显下降,且Foxp3+CD4+T细胞比例下降明显。还发现,sMULT干预后弓形虫感染小鼠脾脏NK细胞的IFN-γ分泌增多,IL-4的表达也有所上升,但对所有细胞亚群的IL-10分泌没有明显影响。此外,Real time-PCR结果显示,sMULT1干预小鼠的肝组织中TNF-α和IL-4的水平有所上升,IFN-γ和IL-10的水平下降,但IL-1β和IL-6变化不大。 过表达sMULT1在一定程度上延长了弓形虫感染小鼠的生存期。在感染1w后处死小鼠,Real time-PCR检测了肝脏及外周血中弓形虫529bp基因的载量,结果也显示,sMULT1过表达使小鼠的外周血及肝脏中弓形虫的原虫虫荷明显降低。与Real time-PCR结果一致,处死小鼠后的肉眼观显示病变肝脏的体积变小,且HE染色显示肝组织炎性细胞浸润也显著减少,变性坏死程度减轻。 结论:sMULT1重组质粒干预弓形虫感染小鼠可通过上调活化型受体NKG2D,下调抑制型受体KLRG1的表达而促进NK及CD8+T细胞的活化及增殖潜能,并促进部分细胞IFN-γ的表达从而诱导了较强的Ⅰ型免疫效应。同时,sMULT1还部分抑制了Foxp3+抑制性T细胞的增殖活性,进一步促进了机体的效应性免疫应答,从而降低了小鼠肝脏及外周血的原虫虫荷,减轻了肝脏的病理损伤,并延长了感染小鼠的生存时间。但NK细胞分泌IL-4水平也出现升高,表明机体在积极抗炎的同时,还会分泌II型细胞因子以避免机体过强的炎症反应引起的病理损伤。由此可见,sMULT1可通过多种机制促进机体的免疫杀伤效应,抑制病原体的进一步扩散,调控了感染的发展和转归,是未来进行免疫治疗或干预的潜在分子。