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背景肝脏是脂肪代谢的主要场所之一,脂肪性肝病正严重威胁人类的健康,已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病,且发病率在不断提高,发病年龄日趋年轻化。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)是氧化还原反应的辅酶也是激活各种酶类家族所需要的底物,包括sirtuins蛋白家族和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerases,PARPs)。膳食补充NAD+前体烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)或烟酰胺核苷(nicotinamide riboside,NR)不仅能预防代谢性疾病、神经退行性疾病,还可以预防哺乳动物随年龄增长导致的生理性NAD+水平的下降。烟酰胺核苷激酶1(nicotinamide riboside kinase 1,NRK1)不仅在哺乳动物细胞中作为NR代谢的限速酶,而且对于将细胞外NMN转化为能够被细胞吸收及参与NAD+合成的NR也是必不可少的。肝脏作为调节许多NR代谢的效应器官也显示出较高的NRK1水平,然而,NRK1是否真正介导肝脏增加NAD+在体内的储备很大程度上仍是未知的。此外NAD+补救合成途径中,细胞内利用NAD+来执行反应的酶,比如sirtuins、PARPs等,会消耗细胞内的NAD+而产生烟酰胺(nicotinamide,NAM)。而烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltrans ferase,NAMPT)是将NAM转化为中间产物NMN的限速酶,能够循环利用反应产生的NAM而重新合成NAD+。NAMPT通过其合成NAD+的能力,影响sirtuins、PARPs等依赖NAD+活性的酶,从而调节细胞代谢。最近一些研究表明,NAMPT能够调节非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)疾病过程中的脂质合成,酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)与NAFLD具有相似的组织病理学和分子生物学特征,但NAMPT在ALD中的作用尚不清。目的通过构建非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝小鼠模型,及原代肝细胞的分离培养实验,分别研究NRK1及NAMPT在调节非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝中肝脏NAD+生物合成和脂质代谢的作用。方法1.研究NRK1在非酒精性脂肪肝中的作用及机制(1)通过细胞培养检测腺病毒NRK1的感染效率及NAD+的表达水平。(2)采用尾静脉注射方式感染小鼠,检测NRK1在体内的感染效率及对小鼠的肝脏脂质代谢产生的影响。采用高脂饮食方式构建肥胖小鼠模型,检测小鼠肝脏NRK1的表达水平。通过给予肥胖小鼠模型尾静脉注射腺病毒,评估小鼠血糖、胰岛素敏感性及肝脏脂质代谢变化,检测NRK1对于饮食造成的脂肪肝的作用。(3)通过给予年老小鼠同样的腺病毒注射分析小鼠肝脏脂质代谢及糖代谢,检测NRK1对衰老产生的影响。2.NAMPT在酒精性脂肪肝中的作用及机制(1)通过细胞培养方式,检测酒精对于NAMPT表达的影响及NAMPT腺病毒的感染效率。(2)构建酒精性脂肪肝小鼠模型,检测酒精对于体内NAMPT表达的影响,同时检测NAMPT腺病毒的感染效率及过表达NAMPT对于酒精性脂肪肝的影响。(3)研究NAMPT是否是通过影响沉默信息调节因子2相关酶1(Sirtuin1,SIRT1)活性来调节酒精导致的肝脏脂肪变性。结果1.NRK1在非酒精性脂肪肝中的作用及机制(1)NRK1在原代肝细胞中的表达效率与内源性NRK1相比在mRNA水平提高了将近10倍。过表达NRK1能明显促进以NR为前体物质的NAD+补救合成途径的表达(p<0.05)。(2)过表达NRK1能升高肝脏中NAD+的水平(p<0.05),降低小鼠肝脏甘油三酯含量(p<0.05),干扰NRK1则刚好相反,而血中的甘油三酯含量未受影响。高脂饮食导致小鼠肝脏NRK1表达明显降低(p<0.05),而过表达NRK1,则将增加NAD+的表达,降低小鼠肝脏中脂合成基因的表达,升高脂肪酸β氧化基因的表达,同时改善肥胖小鼠血糖水平及胰岛素敏感性,降低血液中及肝脏中甘油三酯的含量(p<0.05)。(3)衰老同样导致小鼠肝脏中NRK1表达降低(p<0.05),过表达NRK1,将改善衰老引起的肝脏NAD+含量的降低及甘油三酯含量的增加,同时降低血糖水平,增强胰岛素敏感性(p<0.05)。2.NAMPT在酒精性脂肪肝中的作用及机制(1)酒精能够上调原代肝细胞中甘油三酯的含量,下调NAD+及NAMPT的表达(p<0.05),而过表达NAMPT细胞状态将得到改善(p<0.05)。(2)小鼠酒精肝模型表明:酒精能诱导小鼠肝脏甘油三酯及总胆固醇脂含量升高,损害肝功能,降低NAMPT的表达及NAD+的含量(p<0.05),而过表达NAMPT将改善酒精引起的肝功能损害及肝脏脂肪变性等现象(p<0.05)。(3)酒精喂养也能导致沉默信息调节因子2相关酶1(Sirtuin 1,SIRT1)及沉默信息调节因子2相关酶6(Sirtuin 6,SIRT6)在小鼠肝脏中表达降低(p<0.05),而在酒精性脂肪肝小鼠模型中过表达NAMPT不仅可以改善酒精诱导的小鼠肝脏脂肪变,而且还增强了SIRT1的活性及NAD+的含量,而干扰SIRT1能阻断NAMPT对于酒精诱导的肝脏脂肪变性的改善作用(p<0.05)。结论1.过表达NRK1能够改善由于饮食及衰老造成的脂肪性肝疾病及胰岛素抵抗。2.过表达NAMPT能够上调SIRT1通路的活性,减轻由于过量饮酒造成的脂肪肝疾病。