丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染而引起的严重威胁人类健康的传染病。尽管国际上在慢性丙肝防治理论与方法上取得了长足进展,但对HCV发生发展的分子机制了解得并不透彻,特别是针对中国人群的HCV感染自然康复的分子机制仍不清楚。另一方面,缺乏理想的HCV感染动物模型,特别是小型灵长类动物感染模型,从机制与技术上阻碍了HCV疫苗免疫与抗病毒药物研究。　　 本课题第一部分针对中国献血者人群HCV感染自然康复的分子机制这一科学问题开展了研究。HCV感染可分为自然康复性感染者和慢性感染者两个人群。HCV感染转归及其临床表现与宿主和病毒的自然属性以及相互作用有关。目前认为,宿主方面发挥作用的因素可能包括免疫应答和遗传因素,病毒方面的因素包括遗传异质性、病毒载量及病毒基因型等。因此,从宿主和病毒两方面来了解HCV自然康复和慢性感染者问的差别,对于揭示HCV自然康复及慢性感染转归的分子机制,最终控制HCV感染具有重要指导意义。　　 在这部分内容中,我们对来源于我国广东和北京地区献血者中的HCV感染者进行研究,测定HCV感染的自然康复比率与基因型分布,探索HCV自然康复及慢性感染的分子机制。对广东和北京献血者中HCV抗体初筛阳性的血清样品采用两种EIA方法进行抗体再测定,以定量PCR方法测定病毒载量,并采用巢式PCR对核酸进行确认,进而将样本分为三种HCV感染状态,即自然康复性(RNA-/Ab+)、慢性(RNA+/Ab+)和假阳性(RNA-/Ab-)。采用Elisa方法测定血清样品中IFN-α和IFN-γ含量。HCV RNA阳性样品通过分析5’-NCR序列进行基因分型。结果,160份初筛HCV抗体阳性的样品中,自然康复性样品45份、慢性感染76份、假阳性39份,HCV自然康复率约为37.2％。76份HCV定量PCR阳性样品病毒载量范围从59.8 IU/ml到2.43×106 IU/ml(中位值3.67×104IU/ml)。63份可基因分型的样品包括42.9％基因1型、14.3％基因2型、19.0％基因3型和23.8％基因6型。1型为主要基因型,6型主要分布在广东样品中。通过对自然康复性、慢性、假阳性献血者的临床信息(性别、年龄)、HCV抗体水平、血清中IFN含量与HCV基因型进行分析发现,三组HCV感染状态献血者在年龄(x2=12.212,p=0.002)、HCV抗体水平(S/CO值)(x2=74.584,p<0.001)、IFN-γ含量(x2=14.783,p=0.001)和IFN-α与IFN-γ比值(IFN-α/γ ratio)(x2=22.368,p<0.001)上存在显著差异,自然康复组年龄的中位数(26岁)低于慢性感染和假阳性组(30和28岁),IFN-α含量的中位数略高于其它两组(虽然统计学差异不显著,多重比较p=0.197),慢性感染组IFN-γ含量及HCV抗体水平(S/CO值)的中位数高于自然康复性和假阳性组,而其IFN-α与IFN-γ比值(IFN-α/γ ratio)的中位数低于自然康复性感染和假阳性组。在慢性感染人群中,IFN-γ水平与HCV病毒载量呈相反趋势(p=0.064),而且,IFN-α/γ比值与HCV病毒载量呈显著正相关(p=0.037)。各基因型献血者中HCV基因2型抗体水平的中位数高于其它基因型(多重比较p=0.028)。结论:通过比较中国北京及广东地区献血者自然康复性、慢性、假阳性HCV感染间的一系统参数,发现IFN-α应答可能在HCV感染自然康复中起主要作用,而IFN-γ则在HCV慢性感染病毒载量的控制上发挥作用。IFN-α/γ比值在慢性感染中与病毒载量呈正相关,它可能作为一个新的测定指标用于评价HCV感染的远期结果。　　 本课题第二部分针对HCV感染尚无理想的小型灵长类动物模型这一科学难题,建立HCV动物感染模型探索HCV感染自然转归的分子机制。GB病毒B(GBV-B)是一种最接近HCV的病毒,同属黄病毒科肝病毒属。与HCV不同,GBV-B可以感染狨猴(common marmosets,Callithrix jacchue jacchus)并导致急或慢性肝炎,因此是一个有价值的模拟HCV感染的替代病毒。但是GBV-B仍然与HCV存在着差异,不能完全模拟丙型肝炎病毒在体内的感染与免疫状态。因此,以GBV-B基因组为骨架,以来源于献血者人群中一例HCV1b基因型样本的HCV功能性基因取代GBV-B的相应功能区,构建HCV/GBV-B嵌合病毒的狨猴感染模型,探索含HCV完整功能蛋白的嵌合病毒感染自然转归机制,可为HCV免疫防制与抗病毒药物研究提供有效实验动物感染模型技术平台。　　 在这部分内容中,我们以HCV的完整结构蛋白基因(coreE1E2p7)、完整囊膜蛋白基因(E1E2p7)或主要非结构蛋白基因(NS2NS3NS4A)替换GBV—B相应基因构建了三种嵌合病毒HCV-CE1E2p7/GBV—B、HCV—E1E2p7/GBV-B、HCV-NS2NS3NS4A/GBV-B,通过肝内注射嵌合病毒RNA或静脉注射含嵌合病毒的原代狨猴血清,建立HCV/GBV-B嵌合病毒狨猴感染模型。接种病毒后连续监测29-37周,每周股静脉采血,采用定量PCR、巢式PCR鉴定嵌合病毒在狨猴体内复制状况,同时测定血清中ALT、HCV抗体反应性、IFN-α、IFN-γ含量的变化,采用H&E染色观察肝脏组织病理学变化。结果,肝内注射了三种嵌合病毒及GBV-B阳性对照RNA的狨猴均出现了病毒复制的情况,病毒复制周期主要集中在三个阶段,接种病毒后1-6周、8-14周和18-23周。14周之后病毒载量明显降低,23周之后一直到37周,病毒被清除或无法检测到。用含有嵌合病毒、GBV-B的狨猴血清分别静脉接种给其它正常狨猴后,狨猴均出现了传代病毒复制的情况,病毒复制集中在两个阶段,接种血清后1—5周和10-16周,后一阶段病毒载量明显降低,随后病毒会被自然清除,直到29周再次检测到病毒。第29周时,M6(HCV-CE1E2p7/GBV-B传代感染狨猴)和M9(GBV-B传代感染狨猴)血清中检测到病毒,只是病毒载量较低。与原代相比,传代病毒更容易被清除。原代及传代嵌合病毒感染狨猴血清中ALT水平随着病毒的复制有所升高。另外,从组织病理学角度来看,原代及传代嵌合病毒感染狨猴的肝组织均出现淋巴细胞浸润、毛玻璃样变(细胞水肿、核偏移、胞浆中有颗粒状物质)、胆汁淤积、排列紊乱、水肿等典型病毒性肝炎的组织病理学变化。通过血清中嵌合病毒的检测、ALT的升高、肝脏组织中典型的病毒性肝炎的病理学变化证实三种嵌合病毒均可在狨猴体内复制并包装成完整的病毒颗粒。基于成功感染的狨猴,我们监测了病毒复制和清除的整个过程以及HCV抗体反应和IFN水平的变化。抗HCV core抗体可在。HCV-coreE1E2p7/GBV-B原代及传代感染狨猴接种病毒2周后检测到。抗HCV E2和NS3的抗体在各感染狨猴中较弱。在病毒复制和清除的整个过程中,IFN-γ的水平相对比较稳定,而IFN-α的含量会在病毒载量变得较低或病毒被清除之后,出现明显地升高并且持续数周时间。抗体及干扰素在HCV自然转归中的作用还需进一步进行研究。结论:本研究在国内外首次研制成功了HCV完整结构蛋白或主要非结构蛋白与GBV-B的嵌合病毒,建立了狨猴感染模型,记录了病毒复制和清除的整个过程以及HCV抗体反应和IFN水平的变化,初步探索了HCV/GBV-B嵌合病毒在狨猴体内复制、持续与清除,自然转归的分子机制,进而为HCV疫苗及抗病毒药物评价提供了有效的小型灵长类实验动物平台及基础数据支持。同时也引发了我们关于HCV感染机制,包括HCV受体、细胞嗜性的思考,细胞受体与病毒问的相互作用可能不是或不完全是限制HCV或GBV-B感染人或狨猴的决定性因素,宿主的其它细胞嗜性因素还有待发现。　　 综上,本论文一方面针对中国献血者人群,通过各样本问横向比较,研究了丙型肝炎病毒自然康复与慢性感染的分子特征。另一方面,利用献血者人群中一例HCV1b基因型样本的HCV功能基因构建了含HCV完整结构蛋白或主要非结构蛋白基因的GBV-B嵌合病毒狨猴感染模型,实现了从关键技术上解决HCV研究缺乏理想的小型灵长类动物模型的科学难题,纵向跟踪记录了病毒复制和清除的整个过程HCV抗体反应性及IFN水平的变化。论文从人体和实验动物模型两个角度,分别横向比较及纵向跟踪记录,探索了HCV感染自然转归过程中,病毒载量、细胞与体液免疫以及与宿主相互关系的分子机制,揭示了干扰素-α和γ及其动态比值在HCV自然清除和持续性感染病毒载量控制上起到的重要作用。