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目的:本研究基于前期构建的3组大鼠肺组织SAGE库,通过对其中差异表达基因的比较分析,研究针刺对哮喘大鼠基因表达的影响,探讨针灸效应的物质基础,以期阐明针灸效应的现代生物学机制,并为进一步克隆其基因全长和进行功能研究提供依据。
方法:比较分析正常大鼠对照组、大鼠哮喘模型组和大鼠哮喘针刺组SAGE库的差异表达基因,并进一步对哮喘大鼠针刺调节响应的42个差异表达基因进行分层聚类分析和功能比较分析;从中选择11个基因标签进行GLGI扩增,对结果分析和筛选,以修正和补充SAGE数据库。
结果:1.以正常大鼠对照组为参照,大鼠哮喘模型组246个差异表达基因(P<0.05)中,137个表达升高,109个表达降低。其中已知功能差异表达基因以免疫、代谢、核糖体蛋白、细胞周期、癌基因、信号传导等相关基因居多,说明哮喘是一个多基因相关的疾病。
2.以大鼠哮喘模型组为参照,大鼠哮喘针刺组140个差异表达基因(P<0.05)中,81个表达上调,59个表达下调。其中已知功能的差异表达基因以信号传导、代谢、免疫及转录相关基因居多。
3.以正常大鼠对照组为参照,在大鼠哮喘模型组表达异常的基因中,受针刺调节的有42个(P<0.05),针刺后上调的有23个,下调的有19个。其中40个基因表达水平针刺后趋向正常,提示针刺对这些异常表达基因呈良性调节作用。其中已知功能的独立基因主要有信号传导、免疫、离子通道及转运、癌基因相关基因等。
4.42个针刺哮喘响应基因的分层聚类分析发现,有多个转录序列片段、功能未知基因与已知功能的独立基因归为同一类,表达模式上的一致性提示它们与已知功能的独立基因可能具有相似性或相关联系,为今后探讨其可能的功能提供了线索。
5.本研究从上述42针刺哮喘响应基因中选择11个标签进行GLGI扩增,10个标签得到扩增,1个标签扩增产物割胶回收丢失。符合实验要求的4个标签扩增产物测序结果BLAST检索,其中未知基因标签GLGl05匹配到已知基因序列ATPasesynthasesubunit6mRNA,能够代表其生物学信息,补充了SAGE库比对结果。已知基因双重匹配标签GLGl09与MgpmRNA序列匹配,修正了SAGE结果。而未知基因标签GLGl04和已知基因双重匹配标签GLGl10扩增结果尚需进一步验证。
结论:1.大鼠哮喘模型组多种基因的差异表达,说明哮喘是一个多基因相关的疾病。
2.大鼠哮喘针刺组基因表达的差异,说明基因表达的改变是针灸效应物质基础的一部分。针刺对哮喘状态下部分异常表达基因的良性调整,提示了针刺的可能作用途径。
3.GLGI技术是对SAGE技术的修正和补充,为基于SAGE数据的基因组研究提供了有效工具,并拓展了SAGE技术的应用空间,如确认未知基因、验证已知基因等。