背景和目的干细胞具有自我更新以及多向分化潜能,在组织器官的发育以及损伤的修复过程中发挥着重要作用,并且为再生医学以及组织工程提供种子细胞。研究证实乳牙牙髓中含有多向分化能力的干细胞即乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED),在体外环境作用下可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向进行分化,乳牙牙髓干细胞作为一种新发现的干细胞在组织工程学中具有非常光明的应用前景。已有的克隆筛选干细胞的方法程序复杂,周期较长,我们希望应用免疫磁珠技术在体外分离乳牙牙髓干细胞,进一步扩增培养,研究乳牙牙髓干细胞生长曲线、细胞表面抗原标记物的表达以及多向分化能力等,以期建立一种便捷有效的分离方法并明确乳牙牙髓干细胞的生物学特性,并对其成骨能力与骨髓间质干细胞作比较,为乳牙牙髓干细胞更好的应用到组织工程学中提供有价值的信息。2003年SHED由Miura等首次报道以来便成为研究的热点,SHED作为一种新发现的干细胞,在胚胎发育方面与颌面部骨组织具有相同的来源,应用SHED来修复颌面部骨缺损也许更为合适,SHED在取材过程中基本没有痛苦,更为人们所接受,并且脐带血库的成功建立应用,为我们提供了一个很好的榜样或许我们可以同样建立SHED库以备不时只需(在日本、香港、新加坡等国家和地区已有乳牙牙髓干细胞库的成立)。早在1976年Friedenstein就证实骨髓当中含有可以向骨、软骨以及脂肪细胞分化的细胞。骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)是骨髓中一类来源于中胚层的具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞,在不同的诱导条件下可以向骨、脂肪、神经、软骨、心肌、骨骼肌等多方向分化,本研究对SHED的成骨能力与BMMSCs作对比以便为选择合适的种子细胞提供实验数据。人乳牙牙髓干细胞与骨髓间质干细胞成骨能力的比较研究一、方法1 SHED与BMMSCs的收集培养1.1乳牙牙髓细胞的收集和培养依据Miura等的实验方法选取6～10岁健康儿童的滞留乳牙,采用酶消化法培养细胞。将拔出的牙髓组织通过消化、过滤后得到细胞悬液,然后铺于细胞培养瓶内培养。1.2磁珠筛选乳牙牙髓干细胞取生长状态良好的第3代乳牙牙髓细胞,按磁珠试剂盒要求以STRO-1为标记物进行筛选。1.3骨髓间质干细胞的收集培养骨髓收集自健康成年志愿者均已知情同意,年龄26-28岁,骨髓取自髂后上嵴,BMMSCs的收集分离筛选采用全骨髓法。2 SHED与BMMSCs的生长曲线的测定分别取乳牙牙髓细胞、BMMSCs以及通过筛选获得的SHED制备单细胞悬液,MTT法测各孔OD值,连续测10天,以时间为横轴、每天的平均OD值为纵轴绘制生长曲线。3流式细胞仪检测细胞表面标记取分选之后状态良好的两类干细胞分别检测间质干细胞的表面标记物CD29、CD105以及造血干细胞的表面标记物CD34、CD45的表达情况。4体外多向诱导分化两类干细胞在成骨诱导液诱导3周后,分别对其做ALP染色以及茜素红染色；成脂诱导至3周后,对其做油红O染色；成软骨诱导4周后,做免疫细胞化学染色,检测干细胞的多向分化能力。5钙黄绿素法矿盐沉积荧光染色两类干细胞向成骨细胞方向诱导并在在成骨诱导液中添加1μg/ml的钙黄绿素连续培养21 d荧光显微镜下观察矿盐沉积变化。6荧光定量PCR技术检测成骨细胞基因表达水平分别于成骨诱导后7d、14d、21d,用实时定量PCR技术检测成骨基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)骨钙素(osteocalcin, OC)的转录表达水平。7统计学处理采用SPSS13.0统计软件数据进行t检验,结果以均数±标准差(X±S)表示,P<0.05表示差异有显著意义。统计分析方法：整体比较采用重复测量数据的方差分析,同一时间点不同组别的比较采用独立样本的t检验进行分析,若方差不齐则用Satterthwaite近似t检验。二、结果1细胞形态及生长情况筛选的两类干细胞形态相似,大部分细胞呈长梭形,SHED较BMMSCs体积略小,一周之后细胞可达85%融合,细胞呈鱼群样,形态大小相似。2生长曲线的测定三类细胞的生长曲线均成“S”型,但是乳牙牙髓细胞的生长速度比其他两类干细胞的生长速度快,这符合干细胞慢周期的特点。3两类干细胞的间质干细胞表面标记CD29、CD105分别高表达,造血干细胞表面标记物CD34、CD45低表达。4多向分化能力的检测向成脂诱导3周后,油红O染色两类干细胞,镜下可见细胞内有大量的红色脂滴；成骨方面诱导3周后两类干细胞分别制作细胞爬片,碱性磷酸酶染色可以看见呈蓝紫色的阳性表现,茜素红染色可见呈红色阳性表现；成软骨方向诱导四周之后,免疫细胞化学染色可见Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色呈阳性。5钙黄绿素法检测钙盐的沉积诱导至21d时,细胞间隙中可见呈团簇状分布的矿盐沉积；其中SHED组呈现大量团簇状分布的钙盐沉积,较BMMSCs组增多。6荧光定量PCR技术检测成骨基因的表达分别于7d、14d、21d,检测ALP、OPN以及OC三个成骨基因的表达水平,统计学处理提示,在同一时间点两类干细胞的两个成骨基因表达水平没有差异,且随着诱导时间的延长表达水平有相应的变化。三、结论免疫磁珠法可以用来筛选乳牙牙髓细胞,获得的SHED具有干细胞的特性,高表达间质干细胞的表面标记,低表达造血干细胞的表面标记物,并且具有向成骨、成脂、成软骨等方向分化的能力,是一种快速可靠的分选方法。SHED与BMMSCs在向成骨诱导一定时间之后在荧光显微镜下可见SHED钙盐沉积较BMMSCs更多,通过检测不同时间点成骨相关基因的表达水平可以看到,同一个基因随着诱导时间的延长其表达水平也有相应的变化；在同一个时间点相同的基因SHED与BMMSCs表达水平相同说明两类干细胞具有相似的成骨能力。