树突状细胞（DC）是最重要的抗原提呈细胞，指导CD4~+T细胞的活化和分化，参与调节机体全身免疫反应。当机体受到病原感染时，DC通过其模式识别受体感知外来病原导致其成熟和活化。活化的DC提呈抗原给CD4~+T细胞诱导其活化和分化。分化的CD4~+T细胞根据其分泌细胞因子的不同可以分为Th1、Th2和Th17细胞亚群。Th1细胞主要分泌IFN-γ保护机体免受胞内病原感染；Th2细胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子介导体液免疫抗寄生虫感染；Th17细胞主要分泌IL-17抵抗胞外真菌感染和参与自身免疫性疾病（如EAE）的发生发展。因此分化的CD4~+T细胞对于机体抵抗外来病原感染具有十分重要的意义，目前研究的较为清楚的是T细胞内部的信号通路和转录因子是如何调节CD4~+T细胞分化的，关于DC如何调控CD4~+T细胞分化的分子机制还不是十分清楚。C型凝集素受体（CLRs）是指在其胞外区含有CRD（carbohydrate recognitiondomain）结构域的一类蛋白分子，主要表达在髓样细胞，它们在免疫系统中发挥着多种重要的作用。CLRs可以通过识别真菌细胞壁上的糖基或直接诱导DC胞内信号通路活化或协同TLRs介导的信号调节免疫反应。现在已有的研究证明CLRs主要诱导Th17细胞的分化。LSECtin（肝脏和淋巴结窦内皮细胞粘附分子）是本实验室从肝脏中发现的C型凝集素受体。我们的前期研究结果表明：LSECtin特异表达于肝脏的窦内皮细胞（半抗原提呈细胞）和Kupffer细胞（器官特异性巨噬细胞），识别活化T细胞表面的未知配体，负调节T细胞活化，从而抑制刀豆蛋白A（ConA）诱导的急性肝炎的发生发展。这些结果说明LSECtin在肝脏局部免疫反应中发挥重要作用。肝脏是机体内的免疫豁免器官，在其内发生的免疫反应趋向于耐受状态，这与以血液和骨髓为主体的全身免疫反应存在不同。由骨髓细胞分化而来的树突状细胞在全身免疫反应中发挥重要作用，是连接天然免疫反应和适应免疫反应的桥梁。本论文中，我们首先研究在骨髓衍生的树突状细胞（BMDC）是否表达LSECtin。实验结果显示BMDC上表达LSECtin。在不同时间点应用LPS、IFN-γ、IL-4和TGF-β等不同刺激物处理BMDC，发现只有TGF-β处理的BMDC在各个时间点均一致性的下调BMDC上LSECtin的转录，说明TGF-β负调节LSECtin的表达。为了进一步研究BMDC上表达LSECtin的功能，我们应用OVA抗原刺激BMDC和T细胞共培养体系。与LSECtin~+/~+BMDC相比，LSECtin-/-BMDC不影响CD4~+T细胞增殖，但是LSECtin-/-BMDC抑制了CD4~+T细胞分泌IFN-γ（Th1细胞的标志性细胞因子）和IL-17的分泌（Th17细胞的标志性细胞因子），而促进了IL-13（Th2细胞的标志性细胞因子）的分泌。CD4~+T细胞内表达的转录因子T-bet、RORγ和RORα、GATA3分别控制IFN-γ、IL-17和IL-13的转录。我们的研究发现LSECtin-/-BMDC显著抑制T-bet、RORγ和RORα在mRNA水平的转录，同时促进GATA3的转录。CD4~+T细胞表面表达的IL-12受体和IL-6受体/IL-23受体介导的胞内信号通路调节T-bet、RORγ和RORα的转录。我们发现LSECtin~+/~+和LSECtin-/-BMDC的IL-12受体和IL-6受体/IL-23受体的表达不存在差异，说明LSECtin-/-BMDC抑制T-bet、RORγ和RORα的转录并不是因为抑制IL-12受体和IL-6受体/IL-23受体的表达导致的。DC分泌的IL-12p70和IL-6/IL-23分别是诱导CD4~+T细胞向Th1和Th17分化的关键性细胞因子。我们的研究进一步发现，在DC和T细胞的共培养体系中，LSECtin缺失后抑制了IL-12p70、IL-6和IL-23分泌。而在共培养体系中添加IL-12p70或IL-6确实能够挽救由于LSECtin缺失引起的Th1或Th17分化缺陷。BMDC细胞表面表达很多的共刺激分子，其中CD11c、CD40、CD80和MHC-II（I-A/I-E）的表达对于T细胞的分化非常重要，但是LSECtin~+/~+和LSECtin-/-BMDC表达的这些共刺激分子并没有差异。此外，在OVA抗原刺激下，LSECtin~+/~+和LSECtin-/-BMDC分泌的细胞因子也并没有差异。而且与共培养体系相比，OVA抗原刺激BMDC后细胞因子的分泌量也非常低。因此，我们的实验结果说明在共培养体系中，LSECtin促进IL-12p70、IL-6和IL-23的分泌依赖于CD4~+T细胞的存在。前期研究结果表明，CD4~+T细胞表面有LSECtin的未知配体，所以这些结果强烈暗示T细胞表面的LSECtin内源性配体，通过LSECtin反向作用于DC，促进DC分泌细胞因子，从而诱导Th1和Th17细胞的分化。为了证实这个假设，我们应用LSECtin不同的单克隆抗体（CCA023、CFD051和CCB059）模拟LSECtin的配体刺激DC。LSECtin单克隆抗体CCA023、CFD051和CCB059分别识别LSECtin的跨膜区、脖子区和糖基识别结构域（CRD）。我们的研究发现只有CFD051刺激DC后能够诱导细胞因子TNF-α的分泌，说明LSECtin能够诱导DC分泌细胞因子，并且特异的被识别脖子区的CFD051抗体所触发。为了进一步研究LSECtin对DC功能的影响，DC分别接受培养基培养、mIgG1同型对照和CFD051抗体刺激，12h后，我们发现051抗体刺激后MDDC的树突样结构明显增加，这说明LSECtin诱导DC成熟（形态学水平）。为了进一步在分子水平验证LSECtin促进DC成熟，我们分别应用mIgG1同型对照、CFD051抗体和LPS刺激（阳性对照）DC，24h后，检测共刺激分子HLA-DR、CD83和CD86的表达。我们发现CFD051抗体刺激后，这些DC的共刺激分子表达明显上调，因此可以证实LSECtin促进DC成熟。此外，更重要的是我们需要证明DC上表达的LSECtin促进细胞因子的分泌，例如IL-6。我们应用不同浓度的mIgG1同型对照和CFD051抗体刺激DC，24h后，ELISA检测细胞因子IL-6和IL-10分泌。我们发现CFD051抗体促进DC分泌IL-6和IL-10，并且分泌量与LSECtin的抗体浓度呈现剂量依赖性。同样，我们应用相同浓度的mIgG1同型对照和CFD051抗体处理DC，在不同时间点收获DC，检测CFD051抗体对细胞因子IL-6、TNF-α和IL-10转录的影响。我们发现在3h时，CFD051抗体诱导细胞因子IL-6、TNF-α和IL-10转录达到高峰。总之，以上这些结果充分说明DC上表达的LSECtin通过与LSECtin单克隆抗体CFD051的结合促进DC的成熟和分泌细胞因子，暗示CFD051是通过诱导LSECtin胞内信号的活化影响DC的功能。为了研究LSECtin介导胞内信号转导活化的机制，我们首先分析了LSECtin的氨基酸序列，发现在其胞内并不存在信号转导所需的ITAM基序（immunoreceptor tyrosine-based activatory motif），但是在靠近其跨膜区附近有一段富含带正电荷的氨基酸序列WXYWXYWXYY（X代表任意氨基酸，Y代表带正电荷氨基酸）。带正电荷的氨基酸可以与带有负电荷的接头蛋白（DAP12和FceRIg）相互作用，传递信号。通过免疫共沉淀实验，我们证明LSECtin不与接头蛋白分子FceRIg存在相互作用，但是与DAP12存在相互作用，而且这种相互作用依赖于LSECtin的跨膜区。此外我们通过慢病毒感染Jurkat细胞共转LSECtin和DAP12，我们发现DAP12促进LSECtin细胞表面的稳定表达，初步说明LSECtin和DAP12的相互作用是功能性的。上述结果提示LSECtin可能通过与DAP12相互作用，借助DAP12胞内区的ITAM基序（免疫酪氨酸活化基序）诱导胞内信号的发生。综上所述，我们的研究结果显示：T细胞表面的LSECtin未知配体作用于DC上的LSECtin，通过DAP12诱导胞内信号的发生，促进IL-12p70和IL-6/IL-23等细胞因子的分泌，进而诱导初始CD4~+T细胞向Th1和Th17的分化。