没食子酸对非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响及机制研究

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目的:  探索没食子酸通过调节JAK/STAT3信号通路干预非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡,并增强顺铂抗肿瘤作用的机制。  方法:  第一部分:应用MTT法检测不同浓度没食子酸(0~52μg/ml)干预24h对A549细胞增殖的影响,从而筛选后续实验用没食子酸浓度。将A549细胞完全随机分为4组:正常对照组(Control),12μg/ml没食子酸组(12μg/ml GA组),20μg/ml没食子酸组(20μg/ml GA组),28μg/ml没食子酸组(28μg/ml GA组)。分别给予A549细胞含0,12,20,28μg/ml没食子酸的培养基培养6,24,48h,采用MTT法检测细胞生存率;干预细胞24h后,采取流式细胞术测定各组细胞凋亡,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定各组细胞中酪氨酸激酶1(JAK1)、信号转导及转录激活因子3(STAT3)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bax)的基因表达;Western blot检测细胞内JAK/STAT3信号通路中JAK1、STAT3、p-JAK1Y1022、p-STAT3Tyr705、Bax及Bcl-2蛋白的表达。  第二部分:应用MTT法检测不同浓度顺铂(0~32μg/ml)对A549细胞增殖的影响,并根据MTT结果确定顺铂与没食子酸联合用药的浓度。将A549细胞完全随机分为4组:正常对照组(Control),2.5μg/ml顺铂组(Pt2.5μg/ml组),28μg/ml没食子酸组(GA28μg/ml组),2.5μg/ml顺铂+28μg/ml没食子酸组(Pt2.5+GA28组),分别干预A549细胞6,12,24,48h后,采用MTT法检测各组细胞生存率,流式细胞术测定各组细胞凋亡。收集各组干预24h后的细胞,采用结晶紫染色法观察各组细胞形态及数量变化,Western blot检测细胞中JAK/STAT3信号通路相关蛋白JAK1、STAT3、p-JAK1Y1022、p-STAT3Tyr705、Bax及Bcl-2的蛋白表达,细胞免疫荧光技术观察各组细胞核中p-STAT3Tyr705蛋白的表达。  结果:  第一部分:0~52μg/ml GA干预A549细胞24h后,剂量依赖性地降低了细胞生存率,且GA浓度高于28μg/ml时,细胞生存率低于10%;将(12~28)μg/ml GA用于后续研究,(12~28)μg/ml GA处理A549细胞6,24,48h后,GA组细胞生存率显著降低(P<0.01),细胞凋亡比率明显增加(P<0.05),并且随GA浓度增加,干预时间延长,其对细胞的生长抑制及凋亡诱导作用逐渐增强(P<0.01)。同时,干预24h后,GA组细胞中Bax的基因及蛋白表达量较对照组升高(P<0.05),而p-JAK1Y1022、p-STAT3Tyr705和Bcl-2的蛋白表达及Bcl-2的基因表达较对照组降低(P<0.05);并且随GA浓度增加,细胞中Bax、Bcl-2、p-JAK1Y1022及p-STAT3Tyr705的蛋白表达变化呈明显剂量依赖性(P<0.05),但细胞中JAK1、STAT3的基因及蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。  第二部分:给予A549细胞不同浓度顺铂(0~32μg/ml)干预24h后,细胞生存率随着顺铂浓度的增加而降低,且IC50介于2μg/ml至4μg/ml之间。采用2.5μg/ml顺铂处理A549细胞6,12,24,48h后,时间依赖性地抑制了细胞增殖(P<0.05),诱导了细胞凋亡(P<0.05);而2.5μg/ml顺铂联合28μg/ml GA干预A549细胞6,12,24,48h,更为明显地抑制了细胞增殖(P<0.01),并增加了细胞凋亡(P<0.01)。2.5μg/ml顺铂干预A549细胞24h后,明显减少了细胞数量,改变了细胞形态,并且上调了细胞中Bax蛋白的表达(P<0.05),下调了细胞内Bcl-2、p-JAK1Y1022及p-STAT3Tyr705蛋白的表达(P<0.05)。此外,2.5μg/ml顺铂联合28μg/ml GA干预A549细胞24h后,更为明显地增加了细胞内Bax蛋白的表达,抑制了细胞内Bcl-2、p-JAK1Y1022及p-STAT3Tyr705蛋白的表达。  结论:  (1)没食子酸在体外可有效抑制NSCLC A549细胞增殖并诱导其凋亡;其作用呈浓度和时间依赖性;  (2)没食子酸联合顺铂,较单纯顺铂或没食子酸能更有效抑制NSCLC A549细胞增殖并诱导其凋亡,其作用呈时间依赖性;  (3)没食子酸、顺铂及二者联合作用于NSCLC A549后,均表现为细胞内Bax蛋白的表达上调和Bcl-2、p-JAK1Y1022及p-STAT3Tyr705蛋白表达的下调,表明没食子酸、顺铂抑制NSCLC A549细胞增殖并诱导其凋亡的机制是通过调节JAK/STAT3信号通路实现的。
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