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研究背景和目的肝癌易于局部浸润和远处转移,大部分患者就诊时已丧失手术机会,局部辅助治疗已成为不能手术切除的肝癌患者的重要治疗手段之一。作为一种无创性非侵入性局部治疗肿瘤的新技术,高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound, HIFU)现已广泛应用于包括肝癌在内的多种临床肿瘤的治疗。其应用于肝癌治疗的优点是可较精准聚焦于肿瘤组织而对周围组织影响较少,且受患者一般情况、肝功等影响较小,适应症广;但由于能量衰减、肋弓遮挡、肝脏随呼吸运动移位等因素的影响,HIFU治疗后肿瘤边缘易残余癌细胞。因此在HIFU治疗的基础上联合其他治疗手段,尽可能地杀灭残留癌细胞,是提高HIFU疗效的关键。自杀基因是肿瘤基因治疗中最有成效的方案之一,其原理是通过直接杀伤和旁杀作用杀伤肿瘤细胞,其中单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统是目前治疗肝癌最为常用的方案,但同其他基因治疗方法一样,该系统存在靶向性差、转染率低的问题。最近出现了一种新的基因靶向转染技术:低频超声波破坏携靶基因的超声微泡定位释放技术,该技术能提高靶基因在组织中的转染和表达,有望解决基因治疗所存在的问题。CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell Treg)是一类具有免疫调节作用的T淋巴细胞亚群,它们在维持自身免疫耐受的同时也参与了肿瘤的免疫调节。研究表明肝癌患者的外周血、腹水和肿瘤组织中Treg细胞数量显著升高,机体处于免疫抑制状态。研究还发现,HIFU和HSV-TK/GCV杀伤肿瘤细胞的同时,都能改善机体免疫功能,增强抗肿瘤免疫力。显然,HIFU联合HSV-TK/GCV的靶向治疗为肝癌的治疗提供了新的思路,二者的联合治疗能否增强杀伤效果,是否能协同改善机体免疫力都值得探讨。本课题以兔肝VX2移植瘤为研究对象,重点研究了HIFU治疗联合HSV-TK/GCV靶向治疗对荷瘤兔CD4+CD25+Treg细胞数量及抗肿瘤免疫力的影响,从肿瘤免疫耐受和特异性抗肿瘤免疫两方面对二者联合治疗的免疫学机制进行初步探讨。方法1.携HSV-TK基因超声微泡的制备:将转染了HSV-TK基因的DH5a大肠杆菌大量扩增后,参照OMEGA质粒大抽试剂盒说明书大量抽提纯化质粒,PCR及双酶切电泳鉴定,紫外分光度计检测质粒浓度和纯度;然后采用层层吸附(LBL)法制备携HSV-TK基因及多聚赖氨酸(PLL)的超声微泡,并用光学显微镜进行观察。2.兔肝VX2移植瘤模型的建立:健康新西兰大白兔42只,体质量2-2.5kg,雌雄不限,月龄2-3个月,采用开腹瘤块包埋种植法建立模型。分别于肿瘤接种后第3、4、5周随机处死3只荷瘤兔,解剖观察肿瘤形态及转移情况,并取肿瘤组织行HE染色观察。3.治疗过程:10只健康新西兰大白兔作为对照组,30只荷瘤兔按随机数字表法分为3组:肿瘤组、HIFU组、联合治疗组,每组10只;剩余3只荷瘤兔用于HIFU治疗后疗效观察。治疗点为肿瘤接种后第3周。HIFU治疗参数:功率180W,两层间距3mm,两线间距5mm,扫描速度3mm/s。3只荷瘤兔给予HIFU治疗后立即处死,解剖观察肿瘤形态,并取肿瘤组织行HE染色和TTC染色观察。HIFU组给予HIFU单独处理,肿瘤组行假照处理。联合治疗组于HIFU治疗24h后,经耳缘静脉按0.2mg/kg推注HSV-TK基因并行低频超声辐照转染20min,辐照参数为:300kHz,2W/cm2;24h后经腹腔按50mg/kg连续10d注射GCV治疗。HIFU组、肿瘤组经耳缘静脉推注等量生理盐水,不行低频超声辐照。4.相关指标检测:各组实验兔于治疗后第13天心脏取血,流式细胞术检测兔外周血CD4+CD25+Treg细胞数量的变化情况,Elisa法检测外周血血浆IL-10,TGF-β的浓度;取脾脏组织制备脾淋巴细胞悬液,MTT法检测兔脾淋巴细胞对VX2肿瘤细胞的体外杀伤活性。5.统计学方法:采用SPSS13.0软件对所有数据进行正态性检验,呈正态分布的数据用x±s表示,SPSS13.0统计软件行方差分析,检验水准取a=0.05。结果1.成功提取HSV-TK质粒,并经PCR及双酶切电泳证实,调整浓度为1mg/ml,OD比值[D(260)/D(280)]为1.9;成功制备携HSV-TK基因及多聚赖氨酸(PLL)的超声微泡,调整浓度为0.1μg/μl,光镜下见微泡粒径分布均匀、分散度好。2.接种后第3周肝脏肿瘤大小为1.5±0.31cm,肿瘤呈孤立生长,无肉眼可见的肝内外脏器转移;接种后第4周,肿瘤大小为2.3±0.17cm,其中一只荷瘤兔瘤体中心发生液化坏死;接种后第5周,肿瘤大小为2.9±0.43cm,3只荷瘤兔均发生肝内、网膜及肺部肿瘤转移。肉眼观肿瘤呈类圆形、灰白色,位于肝实质内,无明显包膜,质地较硬,切面呈鱼肉状,肿瘤坏死类型为干酪样液化坏死。光镜下见瘤细胞体积较大,细胞形态呈异形性,排列较为紊乱,胞浆呈嗜碱性,细胞核呈多形性,核/浆比例增大,核大深染,有较多分裂相。3.HIFU治疗后即见靶区灰度值较辐照前明显增加,辐照靶区肿瘤组织无肉眼可见改变,TTC染色实验见HIFU辐照过的肿瘤组织呈苍白色,表明组织已坏死。HE染色见肿瘤细胞水肿,细胞结构虽然完整,但部分细胞间隙增宽、核固缩深染。4 .肿瘤组外周血Treg细胞数量(8.3±0.69)%、IL-10水平(67.82±4.517)pg/ml和TGF-β水平(6.55±0.451)μg/ml相对于对照组(5.3±0.45)%、(54.58±3.528)pg/ml、(5.51±0.266)μg/ml均显著升高(P<0.01) ; HIFU组Treg细胞数量(7.0±0.56)%、IL-10水平(60.32±4.700)pg/ml、TGF-β水平(6.22±0.198)μg/ml明显低于肿瘤组(P<0.01,P<0.05);联合治疗组Treg细胞数量(6.4±0.72)%和TGF-β水平(5.86±0.305)μg/ml低于HIFU组(P<0.05) ,而IL-10水平(58.79±4.416)pg/ml变化则无统计学意义(P>0.05)。杀伤实验显示HIFU组和联合治疗组脾淋巴细胞对VX2肿瘤细胞的杀伤活性分别为(31.62±3.09)%、(29.48±2.68)%,明显高于对照组(13.94±2.45)%和肿瘤组(12.00±2.96)% (P<0.01),但联合治疗组和HIFU组的比较差异无统计学意义。结论1.通过质粒大抽的方法能够获得浓度纯度都较理想的HSV-TK质粒;采用LBL法制备的携基因超声微泡的浓度和大小都能达到要求。2.兔肝VX2移植瘤的生长转移情况和病理表现都与人肝癌较为相似,是一种比较理想的肝肿瘤动物模型。3.HIFU辐照后靶区肿瘤组织灰度值明显增加,发生凝固性坏死,HIFU疗效确切。4.HIFU联合HSV-TK/GCV治疗后,宿主肿瘤免疫耐受情况得到改善,特异性抗肿瘤免疫力增强。