白念珠菌由于具有高适应性和高耐药性，因此易于感染而难以防治。近年来，国际上有大量关于白念珠菌适应氧化应激机制的研究，并有大量文献提示，白念珠菌氧化应激机制可能与其对唑类药物的耐药性有关。因此，白念珠菌氧化应激对于全面阐述其耐药机制有着十分重要的意义。研究目的通过基因敲除的方法，构建MXR1基因缺失菌株，从而研究MXR1基因缺失后对菌株生长、药物敏感性、对H2O2的耐受能力、细胞内活性氧、谷胱甘肽还原体系、线粒体膜电位、氧化应激相关基因表达、CDR1等重要的耐药基因表达、菌丝形成、罗丹明外排及渗透敏感性的变化。研究方法1.构建基因敲除载体质粒：利用PCR、双酶切及DNA连接法，构建MXR1基因敲除载体质粒，该质粒是以p5921质粒为基础，含有MXR1基因ORF两侧的上下游片段及hisG-Ura3-HisG片段。构建后分别采用PCR、双酶切和测序鉴定法，鉴定每一步的阳性质粒。2.构建基因缺失菌：通过URA-Blaster法构建MXR1基因缺失菌株，每一步采用PCR鉴定，最后的阳性菌株采用Southern-blot鉴定。3.生长曲线：将野生菌与MXR1基因缺失菌株，等浓度培养，在不同的时间点测量各菌株的OD600值，从而得到各株菌的生长曲线。4. MXR1基因缺失菌对药物敏感性的实验：通过MIC80和Spot-assay实验，研究MXR1基因缺失菌对药物敏感性的变化。5. MXR1基因缺失菌对H2O2耐药力的实验：通过H2O2液基摇培实验、Spot-assay实验，研究MXR1基因缺失菌对H2O2耐药力的变化。6.细胞内活性氧——ROS含量的测定：将2,7-二氢二氯荧光素二乙酯——DCFH-DA与菌株共培养，在不同时间测定荧光值，从而测定细胞内活性氧（ROS）的含量。7.氧化型和还原型谷胱甘肽含量测定：通过谷胱甘肽还原酶及总谷胱甘肽检测试剂盒测定氧化型和还原型谷胱甘肽含量。8.线粒体膜电位测定：通过线粒体膜电位试剂盒测定线粒体膜电位。9.通过Real-time RT-PCR法，测定氧化应激相关基因SOD2、TRR1、GLR1表达情况。10.通过Real-time RT-PCR法，测定重要耐药相关基因CDR1、CDR2、MDR1、ERG11表达情况。11.在含有小牛血清（FBS）、Lee’s、Spider的培养基培养，以观察MXR1基因缺失对菌丝形成的影响。12.罗丹明6G外排实验：在菌株中加入罗丹明6G测定菌株的主动转运功能。13. MXR1基因缺失对白念珠菌渗透刺激敏感性的影响：通过Spot-assay实验，观察菌株对于SDS、CaCl2、LiCl的渗透刺激敏感性的改变。结果1．本研究首先构建了MXR1基因敲除载体质粒，并采用Ura-blaster方法将白念珠菌中的MXR1基因敲除，从而进行后续的表型分析，进而获得该基因功能的相关信息。2.本研究考察了MXR1基因对于白念珠菌的耐药性的影响。MXR1基因缺失后，菌株对唑类药物敏感性明显上升，对丙烯胺类及多烯类药物敏感性无明显变化。3.本研究考察了MXR1基因对于白念珠菌细胞内氧化应激机制的影响。MXR1基因缺失后，（1）菌株对H2O2的耐受能力下降；（2）细胞内活性氧——ROS水平升高；（3）线粒体膜电位——Δψm增高；（4）某些与氧化还原相关基因（如SOD2等）表达无明显变化；（5）细胞内还原型GSH/氧化型GSSG的比值无明显变化。上述结果提示，MXR1基因在白念珠菌细胞的氧化应激机制中可能起到作用。4．MXR1基因缺失后：（1）菌株中CDR1、MDR1的表达略有上升，（2）而CDR2、ERG11表达无明显变化；（3）MXR1基因缺失对于白念珠菌菌丝的形成无明显的影响；（4） MXR1基因缺失不影响白念珠菌的渗透敏感性。结论白念珠菌的MXR1基因缺失后，对于H2O2的耐受力显著下降，说明MXR1基因可能参与了白念珠菌的氧化应激体系，导致白念抗氧化的能力下降。后来我们又发现，MXR1基因敲除后，白念珠菌细胞内活性氧（ROS）明显升高，本研究首次证实了MXR1基因可减少对ROS的清除。ROS产生的主要部位位于细胞线粒体内，目前国际上通常用线粒体膜电位作为测试线粒体功能的重要指标。由于ROS受MXR1基因的影响，我们进一步考虑MXR1的敲除对于Δψm的影响。结果表明在MXR1基因缺失后，白念珠菌的Δψm显著升高。说明白念珠菌对于H2O2的耐受力显著下降，可能是由于ROS升高、线粒体膜电位升高引起的，因此我们推测， MXR1基因对氧化应激的影响，可能是通过升高线粒体膜电位，并减少对ROS清除而完成的。另外，我们也发现，MXR1基因缺失不改变谷胱甘肽还原体系及氧化应激体系中的某些重要基因，如谷胱甘肽还原酶基因——GLR1、锰-超氧化物歧化酶基因——SOD2和硫氧还蛋白还原酶基因——TRR1的表达，通过本研究中实时定量RT-PCR显示，这三个基因在MXR1敲除前后表达无明显改变。这两个实验说明，MXR1基因缺失菌对于氧化应激的影响，可能不通过这些已知的氧化还原相关基因完成。MXR1参与了白念珠菌细胞内的氧化应激的调节。Real-time RT-PCR结果显示：与亲本菌株RM1000相比较，MXR1基因敲除菌中CDR1及MDR1基因表达略有上升，但是CDR2及ERG11基因的表达无明显变化。因此我们采用检测荧光染料罗丹明6G的含量的方法，来检测白念珠菌的外排功能。亲本菌和MXR1基因缺失菌对罗丹明6G荧光外排没有明显差异，这与之前的Real-time RT-PCR结果中MXR1基因敲除菌CDR1表达略有上升产生矛盾，我们分析可能是由于CDR1基因表达水平仅上升了2.5倍，而后期编码翻译的过程没有明显变化有关。另外我们研究了MXR1基因缺失后菌丝的形成和渗透刺激敏感性的变化，结果表明，MXR1基因缺失对这两者没有明显的影响。文献报道唑类药物除了有已知的抑制麦角固醇的生物合成机制外，提高细胞内活性氧的含量从而达到抑菌作用也是咪康唑抑制白念珠菌生长的重要机制；抗氧化剂可以显著减弱咪康唑的抑菌作用，细胞内活性氧与唑类耐药机制有着密不可分的关系，而白念珠菌细胞内，对于ROS的清除增多可能与其对唑类的耐药有关。我们分别证明了MXR1基因缺失可导致菌株对唑类药物的敏感性增加，同时菌株内的ROS增加。结合以上结论，我们推测，MXR1基因缺失后，导致ROS清除减少，ROS对白念的杀伤作用增强，从而对氟康唑等唑类药物的敏感性增加；而同时由于丙烯胺类和多烯类与氧化应激无明确的关系，导致MXR1基因缺失对这两种药物敏感性无明显变化。同时，这些作用与其他耐药基因的表达无关。我们推测，MXR1基因可能是通过清除细胞内活性氧（ROS）、降低线粒体膜电位参与白念珠菌的氧化应激机制，从而导致对唑类药物的耐药。MXR1基因可能是一种白念珠菌耐药相关基因。