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研究背景：
视网膜母细胞瘤是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，其恶性程度高，不仅对视力有极大损害，并可危及生命。在发达国家视网膜母细胞瘤患儿存活率可达百分之九十，我国绝大部分视网膜母细胞瘤患者临床就诊时往往已经到了中晚期，对于中晚期的视网膜母细胞瘤的治疗临床上目前仍以眼球摘除为当前主要治疗手段。眼球摘除使患儿致残并给患儿造成心理障碍，放射治疗给患儿带来严重并发症并可造成面部畸形，在挽救患儿生命并保住视力是我们迫切期待的，因此需要寻找新的有效化疗方法和化疗药物，然而肿瘤细胞耐药、逃逸凋亡导致肿瘤对多种生物化疗药物的耐受使目前肿瘤化疗受到极大的限制。
近年来的研究表明肿瘤细胞能够以非凋亡途径发生细胞死亡即自噬性细胞死亡，并有文献报道一定程度的自噬可以增强化疗疗效，若能增强自噬的激活也会直接导致肿瘤细胞自噬性死亡，从而自噬作为一种新的化疗手段越来越受科研工作者的关注。自噬性细胞死亡又称Ⅱ型程序性细胞死亡是细胞通过形成自噬溶酶体，降解其所包裹的细胞器和细胞内废弃的蛋白内容物以实现细胞自身的代谢需要和细胞器的自我更新，自噬广泛存在于真核细胞的病理生理过程中包括肿瘤的发生发展和抗癌治疗。正常的细胞通过清除细胞内过剩、损伤、衰老及废弃的蛋白和细胞器维持细胞自身内环境的稳态。随着90年代自噬相关基因的陆续发现及自噬调控机制逐渐的阐明，通过调控自噬信号途径来治疗各种肿瘤，已逐渐被临床接受并开始使用。先前曾有文献报道使用三氧化二砷治疗视网膜母细胞瘤可导致视网膜母细胞瘤细胞生长周期停滞，细胞出现凋亡。最近又有临床研究数据显示三氧化二砷在治疗急性早幼粒细胞白血病患者和多发性骨髓瘤患者时并未出现明显毒副作用且临床剂量浓度的三氧化二砷安全可靠有效。三氧化二砷可诱导肿瘤细胞发生凋亡途径的死亡，国内外早已有报道，而临床上使用三氧化二砷诱导肿瘤细胞通过凋亡途径的细胞死亡为临床服务已经十分常见。关于三氧化二砷是否可诱导视网膜母细胞瘤发生自噬并导致自噬性死亡，国内外未见报道。
1.研究目的
1.1研究临床化疗药物三氧化二砷能否诱导SO-Rb50细胞发生自噬及自噬的结局；
1.2寻找三氧化二砷致SO-Rb50细胞发生自噬的最佳作用时间和有效浓度，研究自噬相关信号通路的基因表达，为寻找靶向于自噬分子机制的抗肿瘤药物提供理论依据。
2.实验方法
2.1用梯度浓度的As2O3处理SO-Rb50细胞，MTT法测定As2O3对SO-Rb50细胞系增殖的抑制作用；
2.2构建自噬标记物pGFP-LC3转染SO-Rb50细胞，经不同浓度As2O3处理48h后行激光共聚焦显微镜检测自噬激活；
2.3 MDC自噬特异性染料行荧光染色检测自噬泡，透射电镜检测自噬，流式细胞仪定量检测各处理组MDC荧光颗粒阳性细胞百分比及凋亡比列；
2.4 RT-PCR、Western blot检测As2O3诱导的SO-Rb50细胞自噬死亡的相关基因转录激活及表达情况。
3.结果
3.1 As2O3对SO-Rb50细胞系的增殖有抑制作用随给药时间和给药浓度的增加，抑制作用越显著；
3.2处理组和阳性对照组可见GFP-LC3绿色荧光蛋白呈点状聚集在相应自噬泡，未处理组GFP-LC3绿色荧光蛋白弥散分布；
3.3空对照组仅含10％胎牛血清培养基的SO-Rb50瘤细胞48h后见极少MDC阳性荧光颗粒且弥散分布；经不同浓度As2O3处理的SO-Rb50瘤细胞48h后可见明显聚集的点状MDC阳性荧光颗粒聚集在细胞质相应的自噬发生区且MDC阳性细胞数显著增加；同时自噬的阳性对照组Rapamycin处理的SO-Rb50瘤细胞，全视野下可见半数以上的SO-Rb50瘤细胞大量的点状荧光颗粒聚集；
3.4透射电镜检测见阴性对照组瘤细胞形态基本正常，未见明显改变;As2O3处理组48h后出现大量双层膜状结构及自噬溶酶体，同时胞质内线粒体发生肿胀，阳性对照Rapamycin处理组同样可见自噬溶酶体；
3.5 MDC流式结果显示As2O3处理组较空对照组即10％胎牛血清培养组，自噬泡阳性瘤细胞百分比随As2O3浓度递增而增加，空对照组未见自噬泡阳性瘤细胞，自噬发生48h后随时间的延长自噬百分比呈下降趋势；
3.6凋亡流式结果显示凋亡在给药早期百分比低下，而在给药晚期则凋亡百分比明显上升；
3.7 RT-PCR见含胎牛血清培养基的未处理组MAPlLC3转录水平未见表达，处理组较阳性对照组条带稍暗；Western Blot见处理组与未处理组72h后BNIP3和Beclinl均有表达，处理组较未处理组表达量明显增加。
4.结论
4.1 As2O3能明显抑制SO-Rb50瘤细胞的生长，并可诱导SO-Rb50瘤细胞发生自噬，其机制可能与BNIP3和Beclinl基因转录表达上调相关;
4.2 SO-Rb50瘤细胞经As2O3处理后，早期自噬发生呈明显的浓度时间依赖性，随着处理药物浓度的增大自噬程度增高；4.3自噬在As2O3致SO-Rb50瘤细胞死亡早期中起重要作用，晚期SO-Rb50瘤细胞大量死亡自噬比例明显下降，可能为自噬过度激活后导致自噬性死亡或自噬激活凋亡并向凋亡转换促进凋亡途径的细胞死亡。