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镍钛合金因为具有形状记忆效应、超弹性、高阻尼效应等特性,目前已经广泛应用于骨、牙科的整形和修复及心血管介入治疗。镍钛合金虽然具有很多优点,但是其植入体内后仍存在很多问题,如镍离子释放。大量研究证明表面改性处理能够有效减少镍钛合金中镍的溶出,改善其生物相容性,氮化钛涂层是其中的一种表面改性方法。氮化钛涂层前后镍钛合金材料制成的封堵器在生物相容性上有何差别,只有深入理解氮化钛涂层前后镍钛合金材料与细胞相互作用后的机理,才能将其更好地应用于临床,为人类健康作贡献。
本论文的研究目的是在氮化钛涂层前后镍钛合金与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)相互作用的细胞实验基础上,采用基因表达谱芯片技术和生物信息学分析相结合的方法从分子水平分析研究氮化钛涂层前后镍钛合金对内皮细胞基因表达谱的影响,并应用相应的细胞生物学和分子生物学实验方法加以验证,为采用生物信息学分析和实验验证相结合的方法对生物材料与细胞相互作用机理的研究方法打下基础。
本论文的具体工作如下:
1.采用扫描电镜和接触角仪对氮化钛修饰前后镍钛合金的表面形貌、镍含量、亲疏水性进行了表征和计算,结果表明镍钛合金经过氮化钛涂层后,其表面镍含量显著降低,同时其表面接触角明显减小。
2.进行了HUVECs的分离、鉴定和培养,并采用MTT法对HUVECs在氮化钛修饰前后镍钛合金两种材料表面生长24、48、72 h后的细胞增殖率进行了评价。细胞鉴定结果表明本论文中从人脐带静脉中分离得到的细胞为HUVECs。MTT实验结果表明,随培养时间增加,氮化钛涂层和无涂层镍钛合金样品上的细胞数量都逐渐增加。与无涂层镍钛合金相比,氮化钛涂层镍钛合金样品上细胞的增殖率更接近于阴性对照。
3.采用Agilent人类全基因组表达谱芯片(芯片的货号为14850)获得了氮化钛修饰前后镍钛合金样品表面培养人HUVECs24h、48h和72h后的基因表达谱,筛选获得了在两种材料表面各时间点发生差异表达的基因共11724个,并对差异表达基因进行了初步整理与统计。
4.应用Cluster& TreeView软件对HUVECs在无涂层镍钛合金、氮化钛涂层镍钛合金上生长作用24、48、72 h后三个实验组发生差异表达的6253、8772个差异表达基因进行层次聚类分析。按照基因差异表达的变化趋势,无涂层镍钛合金聚类出具有较为明显的表达模式共4类,氮化钛涂层镍钛合金聚类出具有较为明显的表达模式共3类。
5.应用GoSurfer软件对镍钛合金样品与HUVECs不同时间相互作用的10102个差异基因中能查到unigene号的8943个基因按照三种表达模式(全部上调、全部下调、上下调)进行了生物学过程GO分类。并应用GoSurfer软件分别对氮化钛涂层和无涂层镍钛合金上的6253、8772个差异表达基因进行表达模式分析。
6.应用GenMAPP软件对氮化钛修饰前后镍钛合金样品表面生长不同时间(24h、48h、72h)的人HUVECs发生差异表达的全部基因涉及的生物学途径进行了分析,共得到了包括差异表达基因的MAPPs100个,对其中8个MAPPs代表的生物学途径进行了详细讨论。
7.以无涂层镍钛合金样品为对照,利用生物信息分析应用平台Ingenuity PathwayAnalysis(IPA)分析了氮化钛涂层镍钛合金样品上不同时间的差异表达基因网络关系,分别得到了三个时间点(24h、48h、72h)的3组网络图。并对这三个时间点打分值排名较前的8个相互作用网络进行分析和讨论。
8.采用流式细胞仪检测、荧光定量RT-PCR、细胞凋亡实验、细胞炎症反应检测实验对前期生物信息学分析结果进行了验证,结果与前期分析结果一致。