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目标探究血红素对斑马鱼胰腺外分泌酶原基因表达调控的分子机制,为卟啉症的诊断和治疗提供分子生物学和遗传学的理论依据。同时进一步阐明血红素作为信号分子发挥功能的具体信号通路。方法本实验分七个部分研究血红素对斑马鱼胰腺外分泌酶原基因表达调控的分子机制。(1)通过实时荧光定量PCR确定血红素能够控制胰腺外分泌酶原基因(cpa5,ctr1l,ctrb1,ela2l,try,tryl)的表达(2)运用原位杂交实验探究关键调控因子bach1和nrf2在斑马鱼胚胎中的表达情况。(3)通过双色原位杂交实验证实关键调控因子bach1和nrf2同时在斑马鱼胰腺中表达。(4)通过5’-RACE和3’-RACE实验获得bach1基因的mRNA序列信息,并克隆bach1基因编码区序列,构建bach1基因表达载体。(5)通过显微注射capped mRNA进行bach1和nrf2基因的过表达实验。(6)通过显微注射吗啉环修饰的反义寡核苷酸(MO,Morpholinoantisense oligonucleotides)进行bach1和nrf2基因的敲降实验。(7)电泳迁移率实验(EMSA)证实了斑马鱼的MafK蛋白能够结合到胰腺外分泌酶原基因上游的MARE (Maf recognition element)元件上。结果(1)血红素合成缺陷的斑马鱼突变体中6个胰腺外分泌酶原基因的表达下调,同时氯高铁血红素(hemin)能够使突变体中的这些下调的胰腺外分泌酶原基因的表达有所恢复。(2)bach1基因在斑马鱼胚胎的头部、躯干部、内脏部位均有表达。nrf2基因在斑马鱼胚胎的内脏部位、头部、躯干部的神经节点部位表达。(3)bach1和nrf2基因都在斑马鱼的胰腺中表达。(4)获得了bach1基因的序列信息和表达载体。(5)bach1基因的过表达导致6个胰腺外分泌酶原基因下调,相反,nrf2基因的过表达导致6个胰腺外分泌酶原基因上调。(6)bach1基因的敲降导致6个胰腺外分泌酶原基因上调,相反,nrf2基因的敲降导致6个胰腺外分泌酶原基因下调。(7)斑马鱼的MafK蛋白能够结合到胰腺外分泌酶原基因cpa5上游增强子中的MARE元件上。结论血红素能够通过负调控因子Bach1和正调控因子Nrf2的作用实现对胰腺外分泌酶原基因表达的调控。