背景与研究目的：不规则趋化因子(Fractalkine, FKN, CX3CL1)是新近发现的膜结合型趋化因子,主要表达于内皮细胞。越来越多研究表明FKN参与了多种炎症性疾病的病生过程,例如动脉粥样硬化、肾小球肾炎、脑缺血和冠状动脉疾病。抑制FKN的表达被认为有益于炎症性疾病,据报道FKN缺失小鼠脑缺血再灌注损伤程度较野生型小鼠明显减轻,而采用高剂量的FKN抑制剂阿司匹林可以下调动脉粥样硬化小鼠的FKN表达,并缩小动脉粥样硬化斑块。在FKN受体和载脂蛋白E双基因敲除小鼠,动脉粥样硬化斑块的形成明显减轻。然而FKN在心肌缺血以及缺血性心力衰竭是否起作用,目前并不十分清楚。据我们所知,只有一项研究报道了在慢性心力衰竭(CHF)病人的血清可溶性FKN (s-FKN)水平上升,且与心衰的严重程度相关,而在心衰小鼠和CHF病人的心肌组织,FKN的表达水平也升高。我们假设s-FKN对心脏细胞有损害作用,抑制FKN的表达及其作用可能是治疗心肌缺血和CHF的一项新的治疗措施。本研究的目的有以下几点：(1)明确FKN的表达是否与心力衰竭的程度有关；(2)明确在正常状态和缺血缺氧状态,FKN对心肌细胞,成纤维细胞和内皮细胞是否有损害作用；(3)己酮可可碱(PTX)和白藜芦醇(RES)是否可以抑制FKN的作用；(4)在小鼠模型,抑制FKN是否有益于心肌缺血和缺血性心力衰竭。研究方法：1. cDNA基因芯片分析8周龄C57BL/6雄性小鼠,体重约20-25 g,予以主动脉弓缩窄术或假手术。术后8周,采用不同心力衰竭程度的小鼠全心进行基因芯片谱分析。2.细胞培养和处理体外分离培养心肌细胞,心脏成纤维细胞和微血管内皮细胞,在FKN处理组中加入不同浓度的重组可溶性FKN (100,150和200ng/ml),孵育24 h,而药物处理组则在加入100 ng/ml FKN前1 h,用白藜芦醇和己酮可可碱预处理(PTX,1 mg/ml; RES,25μM)。对照组包括了1个未予任何处理组,2个药物溶剂组(PBS和DMSO)。24 h后收集细胞分析心房肽(ANP)、基质金属蛋白酶9 (MMP-9)和细胞间粘附分子-1 (ICAM-1)的基因表达水平。3.缺氧复氧和氧化应激刺激心肌细胞通过建立缺氧复氧(A／R)细胞模型和过氧化氢(H202)诱导的氧化应激模型来分析FKN对心肌细胞的作用。培养新生大鼠心肌细胞于96孔板(每孔1×105个细胞),实验分组如下：(1)A／R组：心肌细胞置于厌氧环境3 h,随后复氧2 h；(2) A/R+s-FKN组(100,150和200 ng／ml)：缺氧复氧结束后,加入不同浓度的可溶性FKN孵育12 h; (3) A/R+RES+s-FKN组：缺氧复氧结束后,加入RES(25μM)预处理1h,再加入FKN (100 ng/ml)孵育12 h。心肌细胞加入H202(100μM)刺激6h诱导氧化应激。6h后,加入不同浓度的可溶性FKN (100,150和200 ng/ml)或RES 25μM预处理1h后再加入FKN 100 ng/ml,孵育12 h。采用MTT法进行细胞生存分析。4.心肌梗死和心力衰竭模型的建立11-12周龄C57BL/6雄性小鼠,体重约23-30 g,戊巴比妥钠(50 mg／kg)腹腔注射麻醉。经胸骨左侧第四肋间开胸,暴露心脏。以8-0尼龙线穿过左心耳下缘1-2 mm处的2／3心肌层,结扎左侧冠状动脉,诱导心肌梗死和随后发生的心力衰竭。12 h后存活的小鼠随机给与RES治疗或丙二醇(溶剂)42 d。假手术组小鼠同样随机给与RES治疗或丙二醇。在心梗术后7,14,30和42 d不同的时间点,采用M型超声对小鼠进行心功能的评估。测量左室收缩和舒张末期内径(LVESd.LVEDd),计算左室短轴缩短率：LVFS=(LVEDd-LVESd)/ LVEDd×100。用于蛋白分析的小鼠心脏保存于-80℃,用于免疫组化的小鼠心脏则置于4%多聚甲醛中固定,心脏切片约4-6μm,包埋于石蜡。实验分4组：假手术组,假手术+RES组,心梗组,心梗+RES组,每组10-12只。5.小鼠心脏Langendorff模型的制备C57BL/6雄性小鼠(11-12周龄),腹腔内注射肝素(2.5 U／g)使之肝素化,20 min后腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg),开胸于1 min内在距主动脉根部约2mm处,用20号注射器针头插入升主动脉,用动脉夹固定后切断主动脉及心脏周围的血管、软组织,迅速取出心脏,置于心脏的灌流装置上,丝线固定。Krebs-Henseleit(K-H)灌流预平衡20 min,关闭灌流开关,全心缺血40 min后,K-H液再灌注。分析ANP、MMP-9和ICAM-1的mRNA表达情况的实验分为以下4组,每组3只：1.对照组(K-H液灌注220 min)2.IR组(缺血再灌注组,缺血40 min,K-H液再灌注180 min)3.IR+FKN组(缺血40 min,含s-FKN 50 ng/ml的K-H液再灌注180 min)4.IR+RES+FKN组(缺血40 min,含RES 25μM和s-FKN 50ng/ml的K-H液再灌注180 min)实验结束后,用于RNA分析的心脏保存于RNA保存液中。心肌梗死面积评估的实验分组如下,每组4只：1.对照组(K-H液灌注100 min)2.IR组(缺血40 min,K-H液再灌注60 min)3.IR+FKN组(缺血40 min,含s-FKN 50 ng/ml的K-H液再灌注60 min)4.IR+RES组(缺血40 min,含RES 25μmol/L的K-H液再灌注60 min)5.IR+RES+FKN组(缺血40 min,含RES 25μM和s-FKN 50 ng/ml的K-H液再灌注60 min)结果：1.FKN表达水平与心力衰竭严重程度的关系基因芯片谱分析结果显示心力衰竭小鼠心肌FKN表达水平明显升高,差异显著(P<0.05)。FKN的表达水平分别与肺重／体重比的对数和心肌脑钠肽(BNP)表达水平呈正相关,与LVFS呈负相关,表明心肌FKN的表达水平与心力衰竭的严重程度相关,统计学差异显著(P<0.05)。2. s-FKN对心脏细胞的作用s-FKN刺激24 h后,心肌细胞ANP,成纤维细胞MMP-9和微血管内皮细胞ICAM-1的mRNA表达水平均较对照组显著上调(P<0.05)。PTX和RES均可以抑制FKN诱导的上述3种基因表达水平的上调(P<0.05),提示FKN刺激可以诱导心肌细胞损伤、促进纤维化和激活内皮细胞。3.s-FKN对心肌细胞生存的作用MTT分析结果显示低浓度(100 ng/ml和150 ng/ml)的s-FKN对非病理状态下的心肌细胞生存无明显影响。建立A／R和H202诱导的氧化应激心肌细胞模型后,再加入不同浓度(100-200 ng/ml)的s-FKN刺激,结果显示A／R和H202刺激可以分别降低心肌细胞生存率25%和43%,加入不同浓度的s-FKN刺激可以进一步降低细胞生存率,同时采用RES预处理细胞后可以降低s-FKN对病理状态的心肌细胞生存的损害(P<0.05)。4.白藜芦醇改善心梗后小鼠生存率RES的治疗可以明显改善小鼠的生存状况,累积生存率从心梗组的55%增加至心梗+RES组的80%(Log-rank test, P=0.022)。5.白藜芦醇减轻心肌重塑和改善心力衰竭与心梗组相比,RES治疗42 d后,小鼠心重体重比和肺重体重明显下降(P<0.001),纤维化程度也明显减轻。心梗组小鼠的超声心动图动态检查结果显示LVEDd和LVESd随时间增加,而LVFS呈进行性下降(P=0.000)。MI+RES组在术后各个时间点LVFS的下降幅度均显著低于心梗组(P<0.05)。6.白藜芦醇降低缺血心脏ANP、MMP-9、ICAM-1和FKN的表达相比假手术组,心梗小鼠心肌ANP、MMP-9、ICAM-1的表达水平明显上调(P<0.01),微血管内皮细胞ICAM-1的免疫活性明显增加,而RES治疗可以部分抑制上述3种基因的表达水平和ICAM-1的免疫活性(P<0.01)。心梗组心肌细胞和微血管内皮细胞FKN的免疫活性明显强于心梗+RES组。免疫印迹结果也证实了心梗小鼠心肌FKN表达水平增高,而RES治疗可抑制FKN的表达(P=0.004)。7.s-FKN对离体急性缺血损伤心脏的影响在小鼠Langendorff心脏模型,缺血40 min,加入FKN再灌注3h后,与对照组相比,IR组的ANP,MMP-9,ICAM-1的表达水平明显上调(P<0.0001)。加入RES则抑制上述基因的表达。在缺血40 min,再灌注60 min后,TTC染色结果表明与IR组相比,IR+FKN组心肌梗死面积增加了约20%(68.3±1.06%vs. 48.7±3.01%,P<0.001),而IR+FKN+RES组和IR+FKN组相比,IR+RES组与IR组相比,心肌梗死面积分别减少了约30%与20%(37.5±3.37%vs.68.3±1.06%;30.6±2.03%vs.48.7±3.01%).结论：1.心力衰竭时,心肌FKN表达水平明显上调,心肌FKN的表达水平与心力衰竭的严重程度呈正相关,提示了FKN可作为一个新的心力衰竭分子标志物。2.FKN可以降低心肌细胞生存率,促进心脏纤维化,激活血管内皮细胞和增加心肌梗死面积,对心脏细胞存在损害作用,其损害作用是心肌缺血和缺血性心力衰竭的部分病理生理机制。3.白藜芦醇既可以抑制FKN的产生,还可以抑制s-FKN对心脏的损害作用,从而改善缺血性心力衰竭小鼠的生存率、心功能和减轻心室重塑,提示抑制FKN的表达及其作用可能是治疗心肌缺血和CHF的一项新的治疗措施。