组蛋白乙酰化作为生物体中最常见翻译后修饰之一,由组蛋白乙酰转移酶家族（HATs）催化,是真核生物调控基因表达的重要方式。GCN5（The general control nonrepressed protein 5）作为组蛋白乙酰转移酶家族重要成员之一,催化多种转录因子的乙酰化,研究表明其活性异常与癌症在内的多种疾病的发生发展相关,是抗癌药物开发的潜在靶点。针对GCN5抑制剂研究一直在进行,但研发工作进展缓慢。现有的抑制剂活性低,骨架单一。因此开发活性强的新型GCN5的小分子抑制剂具有重大意义。在本文中,我们建立并优化了针对human GCN5（hGCN5）的AlphaScreen高通量筛选平台。结合AlphaScreen高通量筛选、放射性同位素实验以及二维相似性结构搜索,我们发现先导化合物DC_HG24-01,能够明显抑制hGCN5的体外活性,同位素活性为IC₅₀=3.1+0.2μM。表面等离子共振实验（SPR）验证了DC_HG24-01与hGCN5 HAT结构域的体外结合,其平衡解离常数为K_D=11.6+1.3μM。针对DC_HG24-01的结合模式分析发现DC_HG24-01占据了hGCN5辅因子Ac-CoA的结合口袋,抑制了hGCN5与其辅因子Ac-CoA的结合。此外,我们通过同位素活性和结合模式分析对DC_HG24-01的构效关系进行了解析,这为后续化合物的结构优化提供了更多信息。在细胞水平上,我们发现DC_HG24-01抑制白血病细胞MV4-11的增殖(IC₅₀=28.4+0.8μM),降低了细胞中H3K14的乙酰化修饰水平。通过流式分析,我们发现DC_HG24-01诱导了MV4-11细胞的凋亡和细胞G1/S期阻滞。综上所述,我们通过AlphaScreen高通量筛选平台,结合生物实验确证,发现了新型hGCN5小分子抑制剂DC_HG24-01,为GCN5相关的疾病治疗提供了新线索,也为hGCN5抑制剂的发现提供了新思路。