猪附红细胞体病是附红细胞体附在猪红细胞表面、血浆及骨髓中引起的一种人畜共患病,其主要症状为发热、贫血以及黄疸。猪附红细胞体病往往不会单独发病,一般与其他猪病如猪繁殖与呼吸综合症、猪瘟等混合感染,危害严重,但是在防治上较为困难,给我国养猪业造成了较大的经济损失。目前在兽医临床中主要以镜检法作为猪附红细胞体病的诊断方式,包括鲜血直接压片法和血涂片染色法,但是这两种方法均不能准确识别病原体,使得镜检容易出现误差。因此急需建立一种准确高效且特异性强的检测方法用于临床生产。本实验主要包括三个实验部分:1、阳性标准质粒的构建。2、猪附红细胞体病荧光定量PCR检测方法的建立。3、猪附红细胞体病荧光定量PCR检测方法的临床应用。根据GenBank上已经发表的猪附红细胞体粘附基因MSG1,在其保守区域内设计一对特异性引物,进行DNA体外扩增,胶回收后测序,测序结果为193bp左右与预期结果一致,与GenBank上已经发表的附红细胞体MSG1同源性一致。将提取的DNA用于质粒构建,构建的质粒用于下一实验的敏感性和标准曲线制作。利用构建的阳性质粒成功建立了猪附红细胞体荧光定量PCR检测方法,结果显示,目的基因扩增曲线呈S型,且每一浓度梯度之间相差的Ct值较均匀;熔解曲线正常,存在单一的熔解峰,且无引物二聚体产生,Tm值为83.5℃;标准曲线的线性方程为Y=﹣2.6342X+39.855,标准曲线的斜率为﹣2.6342,截距为39.855,反应的相关系数R~2为0.9977;特异性良好,与健康猪血DNA、猪繁殖与呼吸综合症病毒、衣原体、弓形虫、猪圆环病毒Ⅱ型之间没有交叉反应。组内重复性实验的变异系数在0.84%~2.98%之间,小于5%;组间重复性试验变异系数在0.65%~4.08%之间,小于5%,说明建立的方法有良好的重复性;检测阳性质粒标准品的最低浓度为8.27×10~1拷贝/μL,比普通PCR检测方法敏感性高1000倍,说明该方法敏感性较好。以上结果说明所建立的猪附红细胞体荧光定量PCR检测方法有良好的反应性。对同样30份血样的检测,荧光定量PCR检测阳性率为63.3%,普通PCR检测阳性率为50%,荧光定量PCR阳性检出率比普通PCR高13.3%。对来自岳阳、衡阳、耒阳、攸县四个县市的204份血样进行检测,结果显示,这四个县市均有猪附红细胞体感染:不同种群感染情况为母猪>公猪>仔猪。结论:本研究成功建立了猪附红细胞体病荧光定量PCR检测方法,该方法具有高效、准确、特异性好、操作简单等优点,检测结果更客观、直接,能够更准确的判定阴性、阳性以及可疑样本。通过对血液样本的检测发现猪附红细胞体病感染情况普遍存在。