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中药复方是中医防治疾病的主要形式,其安全性及有效性均优于单味药。方剂用药是中医药体系的精髓与特色。但中药本身具有“多成分、多作用途径、多靶点、多效应”的特点,组方后各药又能发生相辅相成或相反相成的相互影响,造成中药复方药效机制难以阐明,临床用药难以把握。对中药复方的研究,应以传统中医药理论为指导,以现代药理学技术为手段,采用切合中医药特点的研究方法,对方剂的药效学、药动学进行系统的研究,阐明复方作用的物质基础,剖析其组方规律,揭示其体内过程,才能完整地展示复方作用的全貌。 本课题选择扶正固本名方玉屏风为工具药,通过对该方药效学、药动学特征的研究,旨在探讨该方药效物质基础,组方规律及其体内经时变化过程,并为研究同类方剂提供参考。 玉屏风由黄芪、白术和防风三味药组成,有益气固表止汗之功效,临床主要用于防治外感风邪所致的反复发作性疾病。根据中医经典,玉屏风组方中“黄芪补气固表而御外邪,扶正气而防复发,是君药;白术健脾胃而益气统血,助黄芪固里为臣药;兼伍防风走表而祛风邪,使外邪去营气和”。全方于固表之中寓有疏散,相畏相使,相反相成,安内实外,从而达到固表御邪的目的。 在临床实践中,玉屏风的组方及配伍并非一成不变,常以黄芪+白术这一“药对”为基础,根据患者的临床表现,对组方加以调整,适当地增、减辅助药味,或改变各药味的剂量配比,以达到最佳治疗效果,充分显示了中医治疗“辩证施治、随症加减”的优越性。 为探讨玉屏风抗炎免疫药效的物质基础及配伍规律,本课题以传统中医理论为指导,综合应用分子生物学、血清药理学等现代实验方法及灵敏度高、专属性强的生物样品检测方法,一方面从整体、细胞、分子水平考察玉屏风抗炎免疫效应,研究药效的体内经时过程;另一方面检测复方效应主成分群的体内药动学过程。实验以给药后不同时间点的含药血清为方剂作用物质基础的载体,综合分析复方药效经时变化与体内药量变化的关系,以获得复方体内药效的物质基础相关信息。同时通过拆方实验,考察不同配伍情况下,全方、单味药及药对的药效学、药动学特征,以获得组方配伍规律的信息。通过整体研究,系统分析,定性与定量相结合,离体与在体相结合,宏观与微观相结合,试图建立一种探讨中药复方配伍机制及量效关系的研究思路和方法,同时为玉屏风的临床合理用药,制剂质量控制及工艺改进提供参考。 第一部分玉屏风效应主成分群的确定与定量 中药复方成分复杂,单一有效成分难以涵盖全方的作用,更不能反映各成分之间的相互作用。但与化学药物相似,中药方剂的物质基础也是由一种或数种主要活性成分组成,它们相辅相成或相反相成,共同发挥药理作用。本研究在检索玉屏风及各单味药的药效学、药动学相关信息基础上,结合前期进行的玉屏风、单味药、药对煎剂的指纹图谱和给药后含药血清指纹图谱的研究结果,确定了黄芪甲苷、白术内酯Ⅰ及升麻苷三种成分为玉屏风的“效应主成分群”。建立了 HPLC-ESI-MS同步检测玉屏风煎剂中三种成分的分析方法。经方法学验证,该方灵敏度高、特异性强、重现性好,可用于玉屏风煎剂中“效应主成分群”的浓度测定,也可用于含黄芪、白术、防风的中药复方制剂及中成药主成分的质量控制。应用此法,检测了玉屏风、黄芪+白术、黄芪煎剂等样本含量,为后续研究的用药剂量提供了依据。 第二部分玉屏风对大鼠慢性支气管炎模型的治疗作用 玉屏风临床对上呼吸道感染、哮喘及多种过敏性疾病有良好疗效,其作用可能与调节免疫功能,增强机体抵抗力有关。本研究通过考察该方及其“君药”黄芪、“药对”黄芪+白术对慢性支气管炎模型大鼠的治疗作用,从整体层面验证其抗炎及免疫调节作用,并通过拆方比较,分析方剂作用的物质基础和配伍原理。 用脂多糖(LPS)联合卡介苗(BCG)制备大鼠慢性支气管炎模型。对模型大鼠分别给予玉屏风、黄芪、黄芪+白术煎剂,每日一次,连用21d。以地塞米松为阳性对照药,观察动物的一般状态、行为;光镜观察肺组织病理学改变;透射电镜观察肺组织Ⅱ型肺泡细胞、纤毛等超微结构改变。比较各治疗组与模型组、正常对照组之间的差异。 实验表明,各用药组动物一般状况较模型组均有不同程度改善,其中黄芪组及玉屏风组对体重的改善更为显著,优于地塞米松(p<0.05及p<0.01)。组织形态学研究结果表明,各用药组均使模型大鼠气道分泌物减少,气管上皮层修复,支气管壁炎细胞浸润减轻。透射电镜下可见治疗组大鼠Ⅱ型肺泡细胞板层小体增多,纤毛密度增加。各治疗组动物超微结构病理改变较模型组均有显著改善。其中玉屏风及黄芪+白术组作用更为明显。试验结果证实,玉屏风及黄芪、黄芪+白术均对慢性支气管炎模型大鼠肺组织病理损伤有明显的治疗作用,且该作用与方剂的“君药”黄芪密切相关。 第三部分玉屏风的血清药理学 在确证整体药效的基础上,进行了血清药理学研究,从离体细胞水平考察玉屏风的抗炎免疫作用,分析药效的经时过程,建立其药效-时间关系。通过拆方比较,分析全方、单药和药对的药效动力学差异,进一步阐明方剂药效的物质基础及其配伍机制。 用正常大鼠脾细胞和LPS+BCG诱发慢性支气管炎大鼠肺泡巨噬细胞二种模型,分别考察玉屏风、黄芪、黄芪+白术煎剂给药后,不同时间点大鼠含药血清对脾细胞增殖率及肺泡巨噬细胞释放IL-8能力的影响,建立药效-时间关系。 含药血清对脾细胞增殖率影响实验结果显示,单剂量给药后,各用药组动物含药血清均对正常脾细胞增殖有促进作用,而玉屏风的作用优于其他两组,表现为Emax增高,作用时间维持24h以上,AUE显著增大(p<0.01);多剂量给药后,各组作用均明显增强,三组作用依次为全方优于药对,药对优于单味黄芪。 含药血清对慢性支气管炎模型大鼠肺泡巨噬细胞IL-8释放影响实验结果显示,连续给药21d后,三个给药组含药血清均显示出不同程度地抑制IL-8释放作用,其中以全方的Emax最强(p<0.01),AUE最大(p<0.01)。 结果提示,黄芪单味用药即存在抗炎和调节免疫的药理效应,其与白术组成药对作用增强,而全方药效最强,证实了组方的合理性。 第四部分玉屏风效应主成分群的药动学及其相互作用 本研究建立了效应主成分群血清浓度检测方法。以LC-MS结合乙腈沉淀蛋白法,同步检测血清黄芪甲苷和白术内酯Ⅰ浓度。方法学验证表明,该法专属性强、灵敏度高、重现性好,符合生物样品检测要求。实验结果表明,大鼠灌胃给予黄芪甲苷(20mg·Kg-1)后,吸收缓慢,tmax2.10±0.55h。与白术内酯Ⅰ(2.165mg·Kg-1)及升麻苷(116.9mg·Kg-1)联用后,黄芪甲苷Cmax显著升高(P<0.05),AUC显著增大(P<0.01),Vd变小(P<0.05),Cl减慢(P<0.01)。结果提示,与后两者联用,可能至少部分地改善了黄芪甲苷的吸收与转运,使其能维持较高、较久的有效血药浓度,作用增强。进一步从药动学层面证实了玉屏风配伍的合理性。 第五部分黄芪甲苷在大鼠体内PK-PD模型 以玉屏风单剂量时脾淋巴细胞增殖率作用与黄芪甲苷+白术内酯Ⅰ+升麻苷用药后血清黄芪甲苷浓度绘制血清药浓-时间-效应曲线,可见血清药浓与效应基本对应,可用Emax模型描述。曲线回归方程为: E=2.3137+0.9491C-0.008121C2 结果表明,黄芪甲苷在玉屏风效应中起主导作用。效应峰值呈逆时针滞后,表明效应室不在血液室中,用Sheiner法建立了PK-PD模型,求得主要药效学参数Emax57.8%,EC5041.9ng/ml,ke00.128/h。