结晶度对羟基磷灰石成骨和骨诱导性影响的研究

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羟基磷灰石(HA)具有良好的生物相容性和骨传导性,但经过高温烧结的羟基磷灰石材料由于结晶度高导致可降解性差、成骨效率低,限制了其在骨修复材料中的应用。本研究意在比较不同结晶度的HA的理化性能和生物学性能,通过体外细胞实验筛选出具有良好细胞相容性和促成骨分化能力的HA结晶度,然后制备多孔HA微球支架,通过植入兔背部肌肉内,考察结晶度对羟基磷灰石成骨及骨诱导性的影响。采用化学沉淀法、微波法和煅烧处理制备结晶度从0%100%梯度变化的羟基磷灰石粉体。随着HA结晶度的增大,HA粉体吸附BSA蛋白的能力逐渐减弱,当HA结晶度升至60%以上时,粉体吸附蛋白的总量不会因为初始蛋白浓度的增加而变化;体外成骨实验发现,小鼠间充质干细胞(mBMSCs)与不同结晶度的HA粉体共培养时,细胞均能很好地黏附和铺展;mBMSCs与结晶度高于60%的HA共培养具有良好的细胞活性和增殖效果,而结晶度为0%和45%的HA可以提高mBMSCs的碱性磷酸酶(ALP)活性和成骨相关基因(ALP、Runx2和OCN)的表达。通过机械搅拌和冷冻干燥法引入琼脂糖(Agarose)制备了不同结晶度的Agarose/HA支架,相对于纯相Agarose支架,粗糙度变大,微孔增多,机械强度更加优异。当支架中HA结晶度度低于45%时,支架孔隙率较大,容易吸附BSA蛋白。在复合支架表面培养兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs),rBMSCs与结晶度高于60%的复合支架共培养,细胞活性较好,细胞增殖明显;与结晶度低于45%的复合支架共培养,细胞铺展面积大,ALP活性较高。综合粉体和支架的体外细胞实验的结果,结晶度高于60%的HA粉体,Ca2+离子释放浓度低,细胞活性和增殖效果好;结晶度为45%的HA粉体,早期蛋白吸附量较多,Ca2+离子释放适中,能显著促进干细胞的成骨分化。利用挤出滚圆法制备了不同结晶度的HA微球,通过灌注PLGA,得到不同结晶度的HA多孔微球支架。微球支架具有三维连通大孔结构,孔隙率为35%41%,抗压强度为68MPa。将支架植入兔背部肌肉内,2周无明显降解,4周后0%、45%和60%结晶度的支架中微球少量降解;H&E和免疫组化分析显示,2周时支架均会出现大量的炎症细胞,4周后基本消失,其中45%结晶度的微球支架组,4周后出现的新生血管进入支架内部,量多且直径大,支架完全被纤维组织包裹,成血管能力强,诱导成骨潜力大。
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