在过去的十年间，造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)领域取得了一些重要进展，提高了患者的生存率，但病毒感染仍然是移植相关死亡的一个重要危险因素。造血干细胞移植后患者免疫力低下，疱疹病毒特别是EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）和巨细胞病毒（cytomegaoviyns,CMV）是异基因造血干细胞移植后最常见的病毒感染。无论是EB病毒原发性感染或是巨细胞病毒的再活化，都可能会危及患者的生命。移植后EBV感染的常规治疗包括降低免疫抑制剂量、抗病毒药物、CD20单克隆抗体、化疗以及抗原特异性T细胞输注等。单纯的减少或者停用免疫抑制剂会增加移植物抗宿主病的风险，阿昔洛韦或更昔洛韦等抗病毒药物抑制病毒在体内的复制，而EBV和CMV进入体内后为细胞内感染且大部分处于潜伏周期，处于此阶段的感染，抗病毒药物对之无效。尽管很多病例报道了CD20单克隆抗体治疗移植后淋巴组织增生性疾病(post-transplant lymphoproliferativediseases, PTLD)的有效性，但它会导致超过6个月的B细胞缺乏以及一些其他的副作用。近年来的临床试验已经证实，过继输注抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）能够重建造血干细胞移植后抗病毒免疫，治疗移植后EBV和CMV疾病安全、有效。尽管已经证实过继回输CTL安全、有效，但是由于操作繁琐而没有大规模应用。比如经典的产生EBV-CTL的方法先是采用EB病毒转染B细胞，生成EBV-转化的B淋巴母细胞样细胞（EBV-lymphoblastoid cell line,EBV-LCL），以此作为抗原提呈细胞（大概需要4至6周），然后再以照射或丝裂霉素灭活，反复刺激外周血中的淋巴细胞，诱导扩增针对病毒的特异性CTL（大概需要4至6周）。对于进展期的移植后EB病毒感染性疾病患者没有足够的等待时间进行过继细胞治疗。虽然，目前也有快速分离抗原特异性CTL的IFN-γ捕获技术，以及树突状细胞负载抗原刺激获得抗原特异性CTL的技术，但是，这些技术操作相对繁琐而且成本昂贵。能否简化扩增抗原特异性CTL流程，又能获得临床所需求数量和质量的CTL，本研究对此进行了初步的探讨。本研究通过比较不同培养条件下，对CTL细胞增殖和功能的影响，初步探讨了CTL的培养体系，为简化操作、降低成本，使过继输注CTL提供可能。目的：缺乏优化的抗原特异性CTL培养方案已经阻碍了过继细胞治疗(adoptivecell immunotherapy,ACT)的临床应用，本实验为了简化体外扩增流程、缩短培养时间，制定出符合临床需求的特异性CTL扩增体系，使抗原特异性CTL用于临床治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染性疾病进行了初步的研究。方法：分离96份健康人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC），应用PCR直接测序分析技术(polymerase chain reaction-sequence basedtyping,PCR-SBT）进行HLA-A位点高分辨分型，选择A位点高频率等位基因型进行体外扩增实验。在细胞因子和培养环境相同的情况下，比较不同浓度表位肽对扩增EBV表位特异性CTL的影响；在相同浓度表位肽的情况下，比较培养板与培养袋对扩增EBV表位特异性CTL的影响；在优化的培养条件下，探讨其他高频率等位基因型以及CMV表位特异性CTL的扩增效果，以期建立一套稳定的扩增体系。结果：1．在郑州地区汉族人群中共检出A位点18个等位基因。该人群最常见的HLA-A位点等位基因型为A*2402（17.74%）、A*1101（16.13%）和HLA-A*0201（15.32%）。2．应用不同的表位肽浓度诱导体外培养的抗原特异性CTL，前三天细胞未见明显变化，一周后肉眼可见细胞集落，0μmol/L组和1μmol/L组细胞均长势良好，5μmol/L组细胞则形成集落数目明显减少。各培养组在第7天时，总体扩增倍数差异无统计学意义。至第14和21天时，各组与5μmol/L组相比，差异有统计学意义。进一步检测表位特异性CTL的频率1μmol/L组IFN-γ+CD8+T的频率随着培养时间延长逐渐增加，至21天时达（11.72±5.03）%。在对CTL的细胞毒性试验中，1μmol/L组效应细胞表现出特异性杀伤，非特异性杀伤比例小于15%。3．在应用培养袋与培养瓶扩增抗原特异性CTL细胞的比较中，在培养至第7、14、21天时，两种方案扩增的细胞总量及表型分析差异无统计学意义；经体外扩增14天后，培养袋扩增的细胞以CD3+T细胞为主，占（90.03±10.28）%，CD3+CD8+T细胞比例（52.27±25.38）%，培养瓶扩增的细胞表型与培养袋类似，差异无统计学意义(P>0.05)。在对CTL的细胞毒性试验中，效应细胞表现出HLA限制性杀伤，在培养至21天时培养袋与培养瓶对自体LCL的杀伤在效靶比为20:1(P>0.05)、10:1(P>0.05)、5:1(P>0.05)，差异没有统计学意义。4．培养袋培养的HLA-A*0201、A*1101和A*2402表位特异性CTL细胞两周后细胞总量平均增长5.01倍。培养两周时HLA-A*2402、A*0201和A*1101表位特异性IFN-γ+CD8+T的频率分别为（13.27±2.35）%、（9.74±3.32）%和（10.49±2.56）%。培养前，CD3+T细胞表型构成比为（43.34±20.08）%，CD3+CD8+T细胞（18.25±16.23）%，经体外扩增14天后CD3+T细胞为（88.28±12.23）%， CD3+CD8+T细胞比例（45.83±21.59）%，B细胞和NK细胞比例下降。培养14天的效应细胞与靶细胞在效靶比为10:1孵育24小时后，实验组IFN-γ释放量为（4328±426）pg/ml，对照组为（526±73）pg/ml，两组相比P<0.01。选取培养14天的效应细胞进行杀伤靶细胞试验，效靶比20:l时，效应细胞杀伤自体LCL的杀伤率是(54.28±21.15)%，效靶比10:l时，效应细胞杀伤自体LCL的杀伤率是（41.53±12.28）%，杀伤自体PHA刺激的淋巴母细胞、K562细胞和不匹配的LCL杀伤率均小于15%。5．表位肽诱导扩增CMV特异性CTL2周后，3个CMV血清阳性HLA-A*0201的健康人CD3+CD8+CMV特异性CTL的中位数是22.21（17.53-26.85）%，而血清学阴性的健康志愿者的CD3+CD8+CMV特异性CTL的频数为0（P<0.00）。血清学阳性的细胞总量平均增殖7.18倍，CMV特异性CTL的数目增加中位数1120倍（657-2598倍），血清学阴性的CMV特异性CTL的数目则没有任何增加（P<0.00）。血清学阳性的CTL与负载NLV的T2细胞在效靶比为20:1时，显示出强烈的免疫反应，杀伤率为(78.34±12.06)%，而与负载非相关肽TLN的T2细胞的杀伤率仅(7.00±1.03)%。结论：本研究创立了一种新的病毒特异性CTL培养方案，仅需30ml至50ml外周血经过两周的培养时间即可扩增出符合临床需求的特异性CTL，并建立了稳定的扩增CTL的培养体系。此扩增技术不仅适用于扩增EBV特异性CTL，也适用于扩增CMV特异性CTL。