背景与目的宫颈癌是中国最常见的妇科肿瘤之一,每年宫颈癌的新发病例约13万例,死亡病例数近5万例,占世界总数的20%左右。尽管宫颈癌病因明确,有早期的筛查方法,并且手术及放化疗对宫颈癌的效果较好,然而,仍有部分患者在治疗后复发或转移,目前对宫颈癌复发或转移的机制并不明确,且缺乏有效的治疗手段。因此,需要阐明宫颈癌复发转移的机制,为宫颈癌的治疗提供新的靶点。本项目课题组应用RNA-seq技术发现,UBD在宫颈癌组织中高表达,应用PCR和免疫组织化学验证了 UBD的mRNA及蛋白质在宫颈癌组织中表达升高,并且UBD与宫颈癌的淋巴结转移正相关。这提示,UBD可能在宫颈癌的进展及转移中发挥重要的作用。然而,UBD在宫颈癌中的表达及与肿瘤免疫微环境的关系、UBD在宫颈癌中的表达调控、UBD在宫颈癌中的作用及其作用机制尚不明确。本研究的主要目的有以下三个方面:(1)分析宫颈癌中UBD mRNA的表达、UBD与肿瘤免疫调节相关基因的关系,扩大样本量分析UBD蛋白在宫颈癌的表达及其与宫颈癌临床病理特征及预后的关系;(2)在细胞分子水平和动物体内实验水平探索UBD对宫颈癌细胞增殖、细胞凋亡、克隆形成、细胞侵袭和迁移的影响,明确UBD在宫颈癌中的作用,并探索可能的作用机制;(3)利用生物信息学预测调控UBD的转录因子,利用染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因系统验证转录因子对UBD的调控作用、分析UBD启动子甲基化与UBD的关系,探索UBD在宫颈癌中异常表达的调控机制。方法(1)通过生物信息学分析并比较TCGA数据库中宫颈癌和GTEx数据库中正常宫颈组织中UBD mRNA的表达,利用cBioPortal、DAVID在线分析工具、KEGG及GO对与UBD相关的基因进行功能聚类分析、信号通路分析,利用免疫组织化学染色检测UBD蛋白在正常宫颈组织、初治宫颈癌、复发宫颈癌及癌旁组织中的表达,分析UBD的表达与宫颈癌临床病理特征及预后的关系。(2)通过构建UBD过表达(LV-UBD)及干扰表达(shRNA-UBD)的慢病毒载体,筛选出稳定表达的宫颈癌细胞,或通过瞬时转染小干扰RNA(siRNA)改变UBD在宫颈癌细胞系中的表达,CCK-8检测细胞增殖活力,平板克隆实验检测细胞的克隆形成能力,流式细胞术检测细胞的凋亡,Transwell小室模型检测细胞侵袭和迁移,通过皮下接种肿瘤细胞建立宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,检测细胞在裸鼠体内的成瘤能力;通过尾静脉注射肿瘤细胞建立宫颈癌肺转移模型,检测细胞在小鼠体内的转移能力。(3)利用JASPAR预测调控UBD的转录因子,利用染色质免疫共沉淀(ChIP)、双荧光素酶报告基因实验验证转录因子对UBD的调控作用、利用免疫组化检测转录因子在宫颈癌中的表达,利用甲基化特异PCR(MSP)的方法检测宫颈癌组织中UBD启动子甲基化状态,UBD启动子甲基化状态与UBD蛋白表达的关系,分析TCGA数据库中宫颈癌UBD启动子甲基化水平与UBD RNA的关系。结果(1)UBD mRNA在宫颈癌的表达显著高于正常宫颈组织,与肿瘤免疫信号通路密切相关;与抑制性免疫检查点如CTLA-4、LAG3、PD-1、TIGIT等呈正相关;UBD蛋白在宫颈癌的肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中高表达,在复发宫颈癌中的表达显著高于在原发宫颈癌中的表达,是复发宫颈癌不良预后的独立危险因素。(2)体外细胞实验表明,过表达可以促进宫颈癌细胞的克隆形成、侵袭及转移能力,上调AKT/GSK3β/β-catenin信号通路的相关分子蛋白;相反,干扰UBD的表达可以抑制宫颈癌的增殖、克隆形成、凋亡、侵袭及转移、下调AKT/GSK3β/β-catenin信号通路的相关分子蛋白,瞬时转染siRNA诱导细胞凋亡并增加细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性。裸鼠体内实验表明,干扰UBD的表达抑制宫颈癌细胞的生长,抑制宫颈癌细胞的转移。(3)JASPAR预测在UBD启动子序列存在STAT3的结合位点,STAT3在宫颈癌中普遍高表达,干扰STAT3表达后UBD的表达下降,报告基因实验确定了 STAT3对UBD调控的2个结合位点,ChIP实验验证了 STAT3与UBD启动子2个位点DNA的结合。启动子甲基化检测和生物信息学分析结果显示,UBD蛋白及RNA的表达与UBD启动子甲基化水平均呈负相关。结论(1)UBD在宫颈癌中高表达,与宫颈癌的不良预后相关。(2)UBD通过AKT/GSK3β/β-catenin信号通路促进宫颈癌的进展及转移。(3)宫颈癌中UBD异常表达可能是由于STAT3的转录激活和UBD启动子甲基化的异常。