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【背景】肾小球壁层上皮细胞(PECs)是肾小球内潜在的干细胞,具有自我更新和可被诱导向其他细胞转分化的特征。PECs在某些疾病中某些特定条件下可向足细胞分化,是补充足细胞数量减少的重要机制之一。但调节PECs向足细胞分化的机制并不清楚。同时PECs在肾小球疾病发生发展中的作用研究并不充分。在新月体肾炎中PECs是组成新月体的主要细胞来源,在新月体形成、向纤维性新月体转化的病理生理过程中起了重要作用。新月体肾小球肾炎中PECs的异常活化常伴随CD44的高表达(活化)。而其他肾小球疾病中特别是糖尿病肾病,有研究观察到PECs高表达TGF-β1,但其是否参与了肾小球病变的发生发展还缺乏研究。这些活化的或高表达TGF-β1的PECs是否还具有向足细胞转分化,补充丢失足细胞的作用也没有研究关注。【目的】原代体外培养PECs并维持其生物学特性;探讨线粒体的数量,氧化磷酸化关键酶和线粒体动力学在PECs体外诱导向足细胞转分化时的变化;通过体外ANCA相关血管炎肾损害(AAVN)患者血清和TGF-β1孵育PECs诱导PECs活化,观察活化的PECs是否失去向足细胞转分化的能力及细胞内信号和相关机制。【方法】我们通过细胞筛联合磁性分离的方式获得小鼠肾小球,对小鼠肾小球进行原代培养获得PECs,使用realtime PCR、Western Blot和免疫荧光染色鉴定PECs特异性标志物claudin-1以及干细胞特性蛋白CD133,和CD24的表达;在体外通过VRADM诱导PECs向足细胞转分化并通过Western Blot和免疫荧光染色鉴定足细胞特异性蛋白表达。我们在体外诱导PECs向足细胞转分化,realtime PCR检测mtDNA拷贝数、WB检测线粒体生物合成关键调控因子和线粒体蛋白、动力学相关蛋白的表达。我们使用免疫组织化学染色对新月体肾炎患者肾活检标本连续切片中claudin-1、CD44和TGF-β1的表达和定位进行检测;体外使用AAVN患者血清、TGF-β1刺激PECs,用U0126抑制ERK1/2信号通路,使用VRADM诱导PECs转分化,实验分组如下:(1)对照组、AAVN血清组;(2)对照组,TGF-β1组;(3)DMSO组,TGF-β1组,TGF-β1+U0126组;(4)对照组,VRADM组,AAVN血清组,AAVN血清+VRADM组;(5)对照组,VRADM组,TGF-β1组,TGF-β1+VRADM组。分别通过realtime PCR检测CD44和fibronectin的基因表达,Western Blot检测PECs活化标志分子、足细胞相关蛋白、细胞内信号蛋白MAPK以及线粒体相关蛋白的表达。【结果】通过细胞筛联合磁性分离的方式可以获得纯度较高的肾小球;原代培养PECs表达特异性标志物claudin-1和干细胞标志CD24、CD133,不表达小管上皮细胞标志aquaporin 1,不表达系膜细胞标志α-SMA;体外传代至6代的PECs仍表达PECs特异性标志物claudin-1和干细胞标志CD24、CD133;PECs可以体外被诱导向PECs分化表达足细胞特异蛋白。体外诱导PECs向足细胞转分化过程中伴随着线粒体数量的增加,包括mtDNA拷贝数增多,线粒体转录关键调节因子PGC-1α上调,线粒体呼吸链COX IV和三羧酸循环关键酶p-PDH表达升高;PECs向足细胞转分化过程中,线粒体动力相关蛋白Mfn-1和p-DRP1(S637)表达升高,线粒体动力学倾向于融合大于分裂。AAVN患者新月体中,claudin-1和CD44高表达,连续切片显示TGF-β1与之表达位置相同,呈弱阳性表达。体外AAVN血清和TGF-β1均可引起PECs活化(表达CD44)并合成细胞外基质蛋白Fibronectin,活化时ERK1/2通路;使用ERK1/2特异性抑制剂可以抑制CD44的表达,和细胞外基质的合成;AAVN血清和TGF-β1引起PECs活化后VRADM无法再诱导PECs表达足细胞特异性蛋白,同时线粒体生成受阻。抑制ERK信号可以部分改善活化的PECs向足细胞转分化【结论】体外培养的原代至6代PECs表达特异性标志物claudin-1和干细胞标志CD24、CD133,可以被诱导向足细胞分化。诱导分化过程中线粒体数量增加,线粒体倾向于融合。ERK1/2信号通路参与AAVN和TGF-β1诱导的PECs异常活化,异常活化的PECs失去向足细胞分化的能力,伴有线粒体数量增加受阻和线粒体动力学改变。