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目的:探讨NF1基因编码的神经纤维瘤蛋白在诱导C2C12细胞成骨分化中的作用,为Ⅰ型神经纤维瘤病(type 1 neurofibromatosis,NF1)患者临床多伴发骨骼病损的现象提供理论基础。同时探讨淫羊藿苷(ICA)在敲除NF1基因的C2C12细胞模型中的促成骨分化作用及其相关分子机制,将从新的视角为NF1骨骼疾患的有效防治提供思路和靶点。
方法:通过CRISPR/Cas9单载体慢病毒向C2C12细胞系中导入CAS9蛋白和sgRNA序列表达框,从而实现对NF1基因的敲除,构建了敲除NF1基因的C2C12细胞模型。通过添加骨形态发生蛋白2(BMP2)开始诱导敲除NF1基因的C2C12细胞模型成骨分化,检测细胞模型的成骨分化能力,从而研究神经纤维瘤蛋白与细胞成骨分化功能之间的关系。接下来在诱导敲除NF1基因的细胞模型成骨分化的过程中加入淫羊藿苷,观察其对细胞模型成骨分化能力的影响,并研究淫羊藿苷在用药过程中发挥作用的分子机制。
结果:(1)在C2C12细胞上导入CRISPR/Cas9单载体慢病毒,感染病毒后抽提实验组细胞的基因组经PCR测序鉴定套峰,证明确实在对应sgRNA处发生基因编辑。而后采取Westernblot和免疫荧光染色法,直接鉴定细胞中的目的蛋白是否消失。最后得到两株敲除NF1基因的稳转C2C12细胞株,成功构建了NF1基因敲除的成骨分化细胞模型;(2)诱导敲除NF1基因的细胞模型成骨分化后,通过qRT-PCR检测成骨分化标志基因的mRNA表达水平以及碱性磷酸酶的活性测定,验证了神经纤维瘤蛋白具有促进成骨分化的能力。敲除NF1基因后,神经纤维瘤蛋白表达缺失,细胞模型成骨分化功能出现障碍;(3)在诱导敲除NF1基因的细胞模型成骨分化过程中加入淫羊藿苷,观察到淫羊藿苷对细胞模型成骨分化具有促进作用;(4)通过cAMP/PKA/CREB通路解释淫羊藿苷促进敲除NF1基因的细胞模型成骨分化的分子机制。淫羊藿苷在促进敲除NF1基因的细胞模型成骨分化的过程中,可以提高细胞内cAMP的水平,增强PKA、CREB的磷酸化,从而激活细胞模型内cAMP/PKA/CREB信号通路。在使用了可以抑制cAMP/PKA/CREB信号通路的PKA抑制剂(H89)后,可以显著抑制淫羊藿苷在敲除NF1基因的细胞模型中的促成骨分化作用。
结论:本课题成功构建了敲除NF1基因的C2C12成骨分化细胞模型并加以验证;而后发现NF1基因敲除后对细胞模型成骨分化能力产生抑制作用;然后将淫羊藿苷应用于敲除NF1基因的细胞模型,研究发现淫羊藿苷可以促进细胞模型的成骨分化能力,并且这个过程是通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路实现的。本课题的创新之处在于:这是第一次在C2C12细胞系上进行NF1基因永久稳定的敲除。利用该模型我们可以更加深入的研究NF1骨骼疾患发病的分子机制;这也是首次将淫羊藿苷应用于NF1细胞模型来观察其促成骨分化作用,这些研究国内外尚无文献报道。研究成果将为今后临床进行NF1骨骼疾病的防治和药物的研发提供新思路和新靶点,具有重要的理论意义和应用价值。
方法:通过CRISPR/Cas9单载体慢病毒向C2C12细胞系中导入CAS9蛋白和sgRNA序列表达框,从而实现对NF1基因的敲除,构建了敲除NF1基因的C2C12细胞模型。通过添加骨形态发生蛋白2(BMP2)开始诱导敲除NF1基因的C2C12细胞模型成骨分化,检测细胞模型的成骨分化能力,从而研究神经纤维瘤蛋白与细胞成骨分化功能之间的关系。接下来在诱导敲除NF1基因的细胞模型成骨分化的过程中加入淫羊藿苷,观察其对细胞模型成骨分化能力的影响,并研究淫羊藿苷在用药过程中发挥作用的分子机制。
结果:(1)在C2C12细胞上导入CRISPR/Cas9单载体慢病毒,感染病毒后抽提实验组细胞的基因组经PCR测序鉴定套峰,证明确实在对应sgRNA处发生基因编辑。而后采取Westernblot和免疫荧光染色法,直接鉴定细胞中的目的蛋白是否消失。最后得到两株敲除NF1基因的稳转C2C12细胞株,成功构建了NF1基因敲除的成骨分化细胞模型;(2)诱导敲除NF1基因的细胞模型成骨分化后,通过qRT-PCR检测成骨分化标志基因的mRNA表达水平以及碱性磷酸酶的活性测定,验证了神经纤维瘤蛋白具有促进成骨分化的能力。敲除NF1基因后,神经纤维瘤蛋白表达缺失,细胞模型成骨分化功能出现障碍;(3)在诱导敲除NF1基因的细胞模型成骨分化过程中加入淫羊藿苷,观察到淫羊藿苷对细胞模型成骨分化具有促进作用;(4)通过cAMP/PKA/CREB通路解释淫羊藿苷促进敲除NF1基因的细胞模型成骨分化的分子机制。淫羊藿苷在促进敲除NF1基因的细胞模型成骨分化的过程中,可以提高细胞内cAMP的水平,增强PKA、CREB的磷酸化,从而激活细胞模型内cAMP/PKA/CREB信号通路。在使用了可以抑制cAMP/PKA/CREB信号通路的PKA抑制剂(H89)后,可以显著抑制淫羊藿苷在敲除NF1基因的细胞模型中的促成骨分化作用。
结论:本课题成功构建了敲除NF1基因的C2C12成骨分化细胞模型并加以验证;而后发现NF1基因敲除后对细胞模型成骨分化能力产生抑制作用;然后将淫羊藿苷应用于敲除NF1基因的细胞模型,研究发现淫羊藿苷可以促进细胞模型的成骨分化能力,并且这个过程是通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路实现的。本课题的创新之处在于:这是第一次在C2C12细胞系上进行NF1基因永久稳定的敲除。利用该模型我们可以更加深入的研究NF1骨骼疾患发病的分子机制;这也是首次将淫羊藿苷应用于NF1细胞模型来观察其促成骨分化作用,这些研究国内外尚无文献报道。研究成果将为今后临床进行NF1骨骼疾病的防治和药物的研发提供新思路和新靶点,具有重要的理论意义和应用价值。