食管癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率有很大的地区差异性。中国是食管癌发病率最高的国家,每年新诊断的食管癌一半以上发生在中国。河南省北部的安阳地区是我国也是世界的食管癌高发区,发病率高达478/10万。我国食管癌最常见的病理类型是鳞状细胞癌,尽管应用手术、化疗和放疗等手段,生存率有了很大提高,但由于易出现复发和转移,预后仍很差。寻找与食管鳞癌预后相关的因子,对预后差的患者实行更积极的治疗是提高食管癌治愈率的重要方法。C-kit又称CD117,是由原癌基因c-kit编码的Ⅲ型酪氨酸激酶受体,与其配体干细胞因子(stem cell factor, SCF)结合后,发生自身磷酸化从而激活其下游的信号传导通路,在细胞增殖、凋亡、细胞分化中发挥重要作用。最近的研究发现,c-kit和SCF的共表达在卵巢癌、小细胞肺癌和肝内胆管细胞癌的发生发展中有重要作用,并且c-kit的高表达在许多肿瘤中提示预后差。但食管癌中c-kit和SCF表达的情况及其与预后的关系,迄今为止未见有文献报道。鉴于上述原因,本研究拟探讨c-kit和SCF在食管鳞状细胞癌中的表达情况及和预后的关系,并采用RNA干扰的技术沉默KYSE70细胞系中c-kit基因的表达,通过观察细胞的生物学行为变化从而研究c-kit在食管鳞癌发生发展中的作用。第一部分C-kit和SCF在食管鳞癌中的表达情况及其与临床预后的关系目的探讨c-kit及其配体SCF在人食管鳞状细胞癌组织中的表达情况及两者与食管鳞癌临床病理和预后的关系。材料与方法1采用免疫组织化学的方法检测157例食管鳞状细胞癌组织和10例正常的食管粘膜上皮中c-kit和SCF蛋白的表达情况。2免疫组化结果判定和定量分析：根据免疫反应的着色强度和着色范围进行评分,具体评分方法如下：(1)按阳性肿瘤细胞数占肿瘤细胞数的百分比：无阳性细胞记为0分；阳性细胞小于10%记为1分；10%～50%记为2分；大于50%记为3分。(2)按切片中细胞着色程度即深浅评分：细胞无着色记为0分；浅黄色记为1分；棕黄色记为2分；棕褐色记为3分。取(1),(2)两项评分的乘积共有0、1、2、3、4、6、9作为最后的评分。终评分0分记为阴性；终评分1、2分记为弱阳性；终评分3、4分记为中等阳性；终评分为6、9分记为强阳性。3统计学处理：应用SPSS17.0软件进行数据处理,有序变量之间的联系用Spearman相关分析,相关系数用来确定变量因子之间相关的强度；分类变量之间的比较用Pearson’sX2检验；用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,并用log-rank检验比较各组之间的差异。Cox风险模型评估各指标对预后的独立影响。P≤0.05认为有统计学差异。结果110例正常食管粘膜中未检测到c-kit和SCF的表达,157例食管鳞状细胞癌组织中有38例共表达c-kit和SCF,共表达率为24.1%,其中c-kit和SCF的表达率分别29.9%和33.1%。两种蛋白在食管鳞癌中的表达有相关性,P＜0.001。进一步用Spearman’s相关检验证明,c-kit与SCF表达呈正相关,相关系数为0.553。2C-kit的表达与T分期,即浸润深度(P＜0.001)、淋巴结转移(P=0.019)、远处转移(P=0.015)及临床分期(P=0.021)密切相关。Spearman’s相关系数分别为0.435、0.194、0.194和0.190。在c-kit表达阳性的肿瘤患者的复发和转移率高于c-kit表达阴性的患者,分别是34.8%和18.9%,P=0.034。3SCF的表达与浸润深度(P=0.000)、肿瘤大小(P=0.014)、淋巴结转移(P=0.018)、远处转移(P=0.002)及临床分期(P=0.003)密切相关,Spearman’s相关系数分别为0.373、0.227、0.186、0.240和0.239。SCF表达阳性的肿瘤患者复发和转移率高于SCF表达阴性的患者,复发和转移率分别是32.7%和18.1%,P=0.042。4C-kit表达阴性患者的中位DFS明显长于表达阳性患者的中位DFS,分别为126.875个月(95%CI115.375.138.385)和80.284个月(95%CI63.760-96.808),P=0.010。SCF表达阴性患者组的中位DFS也明显长于阳性表达患者组的中位DFS,分别为126.862个月(95%CI115.347.138.377)和96.038个月(95%CI75.786.116.290),P=0.030。5C-kit阳性表达组的中位OS远远短于c-kit蛋白表达阴性组的中位OS(P<0.001),分别为55个月(95%CI33.142.76.858)和127个月(95%CI89.546.164.454)。患者中位OS在弱表达组、中度表达组和强表达组中逐渐缩短,(P=0.034)。SCF阳性表达组患者的中位OS为60个月(95%CI30.155-89.845),表达阴性组患者的中位OS为127个月(95%cI94.922.159.078),P=0.001。6C-kit和SCF共表达的患者中,中位生存期为39个月(95%CI9.397.77.603)；而无共表达的患者中位生存期为119个月(95%CI88.260.149.740)。c-kit和SCF共表达的患者无共表达患者有更短的中位生存期(P=0.000)。7C-kit蛋白表达(P=0.002)、SCF蛋白表达(P=0.025)、远处转移(P=0.023)和淋巴结转移(P=0.045)均是食管鳞状细胞癌独立的预后因素。结论1C-kit和SCF在正常食管粘膜组织中无表达,在人食管鳞癌组织中的阳性表达率提高,提示SCF/c-kit可能参与了食管鳞状细胞癌的发生过程。2C-kit及其配体SCF在食管鳞癌组织中的表达和浸润深度、淋巴结转移、远处转移及临床分期密切相关,提示SCF/c-kit可能参与了食管鳞状细胞癌浸润和转移的过程。3C-kit和SCF阳性表达的患者无病生存期和总生存期均缩短,提示SCF和c-kit可能是食管鳞癌的预后相关因子。第二部分RNA干扰沉默c-kit基因表达对KYSE70细胞体外生物学行为的影响目的探讨c-kit及其配体SCF在人食管鳞状细胞癌细胞系KYSE70中的表达情况及RNA干扰沉默C-kit基因表达后对KYSE70细胞体外生物学行为的影响。材料与方法1采用RT-PCR和Western-blotting的方法检测c-kit, SCF和ABCG2在正常培养条件下和低氧培养条件下mRNA和蛋白表达的变化。2运用RT-PCR和Western-blotting检测RNA干扰前后KYSE70细胞中c-kit、SCF、ABCG2mRNA和蛋白表达水平的变化。3运用平板克隆形成实验、MTT法及流式细胞术检测RNA干扰沉默c-kit表达对KYSE70细胞增殖、细胞周期分布、凋亡及药物敏感性的影响。4统计学处理应用SPSS17.0统计软件,Western blots和RT-PCR结果用Gene Tools进行灰度值分析,两样本均数比较采用t检验,多个样本均数比较应用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1食管鳞状细胞癌细胞系KYSE70中有c-kit, SCF和/ABCG2的mRNA和蛋白表达,细胞经低氧培养后,c-kit、SCF和ABCG2的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。2与正常对照组和非特异性干扰组相比,c-kit siRNA组KYSE70细胞中c-kit和ABCG2的mRNA和蛋白表达水平均下降(P<0.05),而SCF的]mRNA和蛋白表达则无明显变化(P>0.05)。3克隆形成实验结果显示：正常对照组克隆形成率为53.63±4.68%,非特异性siRNA干扰组克隆形成率为55.32±6.78%,两组比较无统计学差异(P＞0.05)；而c-kit siRNA组的克隆形成率为17.01±4.83%,与上述两组比较,克隆形成率明显下降(P＜0.05)。4MTT法检测结果显示-KYSE70细胞的生长速率在正常对照组和非特异siRNA组没有明显差异(P＞0.05),但与上述两组比较,c-kit siRNA组细胞的生长速率明显受到抑制,(P<0.05)。相同浓度的5-Fu对正常KYSE70细胞和非特异小RNA处理的KYSE70细胞的抑制率没有明显差别,(P＞0.05)。但在c-kit siRNA组,相同浓度的5-Fu作用后,细胞的存活率明显降低,抑制率显著提高(P＜0.05)。5流式细胞术检测结果显示：正常对照组和非特异性siRNA干扰组KYSE70细胞在G0/G1期的比率分别为46.8±1.34%和49.2±1.37%,两组比较无统计学差异(P＞0.05)；而c-kit siRNA组KYSE70细胞在G0/G1期的比率明显增大,高达77.8±1.45%,与上述两组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05)；KYSE70细胞的早期凋亡率在正常对照组和非特异性siRNA干扰组分别为1.22%±0.72%、2.62%±0.79%,两组比较无统计学差异(P＞0.05)：而c-kit siRNA组的早期凋亡率为27.36%±1.09%,与上述两组相比,早期凋亡率明显升高(P＜0.05)。结论1食管鳞癌细胞系KYSE70表达c-kit、SCF和ABCG2,低氧可上调它们的表达水平。2C-kit基因与食管鳞状细胞癌细胞的增殖有关,抑制其表达能部分抑制KYSE70细胞的增殖,其作用机制可能是阻滞KYSE70细胞于G0/G1期并诱导其凋亡。3RNA干扰沉默c-kit表达能够使食管鳞状细胞癌细胞系KYSE70细胞的耐药性明显下降,其机制可能是通过下调ABCG2的表达,使药物泵出减少。4C-kit可能是食管癌干细胞的标志物之一。