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目的 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是常见的严重影响老年人生活质量的疾病。据统计，我国现有老年痴呆患者大约为300～400万。由于其病因和发病机理不清，至今尚无有效的防治方法，给家庭和社会造成了巨大的负担。 AD的发病与许多因素有关，长期以来形成很多学说，哈佛大学D．J．Selkoe关于AD的学说认为β-淀粉样蛋白(amyloid-β protein，Aβ)的形成和清除障碍是AD发病的早期过程和中心环节，而Aβ的清除与炎症反应有关。探讨免疫细胞与Aβ代谢的关系的关键问题是，免疫细胞能否穿过血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)进入脑内。关于这一问题，目前还有很多争议。 本实验的目的在于探讨AD病人外周血免疫细胞穿过血脑屏障的能力，在此基础上用基因芯片寻找AD病人外周血T淋巴细胞差异表达的基因，研究其在AD病人外周血T淋巴细胞穿过血脑屏障过程中的作用，为进一步研究其分子机制以及寻找干预AD病人T淋巴细胞穿过血脑屏障的途径奠定基础。 方法 1 血脑屏障体外模型的建立：人脑微血管内皮细胞(Human Brain Microvascular Endothelia Cell，HBMEC)为美国Johns Hopkins大学医学院K．S．Kim教授惠赠。将2×10~6个HBMEC加到孔径3微米的Transwell(Costar)24孔培养板上，定时换液，培养3天后细胞达到融合状态，形成脑微血管内皮细胞单层，即为血脑屏障体外模型。 2 AD病人外周血单个核细胞(PBMC)的分离与亚型分析:选取AD病人31例，健康对照25例，清晨空腹采肘静脉血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，以CD4十、CDS十、CD14斗、CD19+流式直标荧光抗体染色，在流式细胞仪上计数各亚型所占比率。 3 AD病人外周血T淋巴细胞的分离:荧光免疫磁珠分离AD病人及健康同龄对照外周血T细胞。 4 AD病人外周血单个核细胞穿过血脑屏障分析:以HBMEC培养液悬浮自外周血中分离得到的PBMC，计数细胞密度，细胞悬液加到BBB模型的升皿swen上层，下层加人培养液，5%CO:37℃培养20小时后收集下层穿过的细胞。用流式细胞仪分型，计算各亚型穿过率。 5用免疫荧光法观察AD病人外周血T细胞与内皮细胞相互作用时内皮细胞紧密连接蛋白20一1和细胞骨架F一actin的变化(与同龄正常对照相比较)。 5.1在盖片上接种HBMEC，培养至完全融合时加入AD病人和同龄正常对照的外周血T淋巴细胞，37℃孵育20小时，用免疫荧光染色检测20-1的变化。 5.2在盖片上接种HBMEC，培养至完全融合时加人AD病人T细胞的模式细胞(6T一CEM细胞系:人T淋巴细胞白血病细胞)，37℃孵育，在不同时间取出盖片，用免疫荧光染色检测不同时间20一1的变化。 5.3在盖片上接种HBMEC，培养至60一70%融合时加人AD病人和同龄正常对照的外周血T淋巴细胞，37℃孵育20小时，用罗丹明标记的毒伞素染色检测HBMEC细胞骨架F一actin的变化。 5.4在盖片上接种HBMEC，培养至60一70%融合时加人6T一CEM细胞，37℃孵育，在不同时间取出盖片，用罗丹明标记的毒伞素染色检测不同时间细胞骨架F一actin的变化。 6筛选AD病人外周血T淋巴细胞与正常同龄对照者之间的差异表达基因:用T细胞荧光免疫磁珠分离AD病人及健康同龄对照外周血T细胞，用Trizol提取总RNA，用Bios往比Hl 405表达谱芯片检测14，的0个基因中差异表达的基因。选取其中的一个差异表达基因MIP一la，用半定量RT-PCR的方法验证AD病人外周血T淋巴细胞中的差异表达。 7研究MIP一la在AD病人外周血T淋巴细胞及其模式细胞6T一CEM细胞穿过血脑屏障过程中的作用 7.1用RT一PCR检验人T淋巴细胞白血病细胞(6T一CEM)表达MIP一la的情况及其是否可以作为研究MIP一la在AD病人T淋巴细胞中作用的模式细胞。 7 .2将用免疫磁珠分离的AD病人外周血T淋巴细胞及6T一CEM细胞加到BBB模型上，同时加人不同浓度的MIP一1a中和抗体，与未中和组比较，分析其血脑屏障穿过率的变化。 7.3在盖片上接种HBMEC，在合适密度时加人等量6T一CEM细胞，同时加入MIP一la的中和抗体，37℃孵育20小时，观察20一1和细胞骨架F一aetin的改变 7.4在6孔板上培养HBMEC，长至融合时加人6T一CEM细胞，37℃孵育，在不同时间取出培养液，离心得到6T一CEM细胞，RT一PCR检测MIP一la翩A表达量的变化。 7.5从AD病人外周血T淋巴细胞克隆并测序MIP一1a基因，并将该基因稳定转染到模式细胞6T一CEM细胞中，为进一步研究奠定基础。结果 1 AD病人外周血免疫细胞分化比例异常:AD病人外周血CDS+、CD14十、CD19十细胞占外周血单个核细胞的百分率低于同龄的正常对照组，其差异有统计学意义(P<0 .01)。AD病人CD4+细胞百分率虽然均值低于正常对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。AD病人外周血CD4+/CDS‘比值显著高于同龄正常对照组(P<0.05)。 2 AD病人CD4+、CDS+、CD14十细胞对BBB的穿过率显著高于正常对照组(P<0.01);CD4‘、CDS‘对BBB的穿过率显著高于CD14子细胞(p<0.01);不论在正常对照组还是AD组，CD19‘细胞对BBB的穿过率均为O。