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日本看麦娘(Alopecurus japorticus)是一种主要分布在我国长江中下游地区,严重危害小麦田的恶性禾本科杂草。精噁唑禾草灵(fenoxaprop-P-ethyl)属于乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂类除草剂,该药剂是防除包括日本看麦娘在内多种禾本科杂草的重要药剂。随着该类药剂的长期大量使用,抗药性问题逐步凸显。靶标抗性是杂草对ACCase抑制剂类除草剂产生抗性的重要机理。由于日本看麦娘的倍性未知,导致以往对日本看麦娘ACCase的基因克隆及序列分析中均忽视了日本看麦娘ACCase基因存在多个拷贝的事实;另外日本看麦娘对精噁唑禾草灵抗药性的靶标酶分子和生化机理更是知之甚少。为明确我国长江中下游地区小麦田日本看麦娘对精噁唑禾草灵抗药性的发生情况及其靶标酶抗性机理,为科学防除抗性日本看麦娘提供理论依据和实践指导,本文研究了江苏、安徽小麦田不同日本看麦娘种群对精噁唑禾草灵的抗药性水平及抗性种群的交互抗性和多抗性;明确了日本看麦娘的倍性及ACCase基因的拷贝数,发现导致日本看麦娘产生抗性的多个靶标酶氨基酸突变;选择性的深入探究具有ACCase氨基酸W1999C(色氨酸-1999-半胱氨酸)和W1999L(色氨酸-1999-亮氨酸)突变抗性种群的靶标酶抗性机理,最后针对发现的抗性突变建立了快速分子检测方法。本研究的主要结果如下:采用种子和整株生物测定法对22个日本看麦娘种群对精噁唑禾草灵的敏感性进行了检定。结果表明:采自安徽合肥的AHFD-1、AHFD-2、AHFD-3种群,江苏常州的JCJT-1、JCJT-2、JCJT-3、JCWJ-1、JCWJ-2 种群,镇江的 JZJR-1、JZJR-2、JZJR-3 种群,淮安的JHJH-1种群,连云港的JLGY-4种群,南通的JNRG-1种群,南京的JNPK-1、JNPK-2种群对精噁唑禾草灵产生了不同程度的抗性;而采自江苏连云港的JLGY-1、JLGY-2、JLGY-3种群,扬州的JYGY-1种群、盐城的JYFN-1种群、南京的JNXW-1种群仍对精噁唑禾草灵敏感。总计22个种群中16个种群对精噁唑禾草灵产生了抗药性,表明所研究地区麦田日本看麦娘对精噁唑禾草灵的抗药性已经发生十分普遍。采自安徽合肥的AHFD-1种群对精噁唑禾草灵的抗性水平最高,种子生物测定结果显示精噁唑禾草灵对该种群的有效抑制中剂量(ED50)为174.88 g a.i.·ha-1,相对于敏感种群(JNXW-1)其抗性倍数为400.09;整株生物测定其ED50为1556.08 g a.i.·ha-1,相对抗性倍数为102.59。该种群整株测定ED50值已远高于精噁唑禾草灵的田间推荐剂量上限62 g a.i.·ha-1。表明日本看麦娘对精噁唑禾草灵的抗性水平已经十分高。采用整株生物测定法研究了抗精噁唑禾草灵AHFD-1种群的交互抗性和多抗性。结果表明:AHFD-1种群对芳氧苯氧基丙酸酯类(APP)除草剂高效氟吡甲禾灵、精吡氟禾草灵、精喹禾灵、炔草酯、噁吐酰草胺,苯基吡唑啉类(PPZ)除草剂唑啉草酯产生了交互抗性,但对环己烯酮类(CHD)除草剂烯草酮、烯禾啶未产生交互抗性;对氟唑磺隆、甲基二磺隆、磺酰磺隆、啶磺草胺、乙草胺、扑草净、绿麦隆、氟乐灵、草甘膦异丙胺盐未产生多抗性。这为合理选择除草剂对抗性日本看麦娘进行化学防除提供了重要理论依据和实践指导。分别采用染色体计数法和流式细胞术,均明确了日本看麦娘为四倍体(2n=4X=28);对日本看麦娘ACCase的基因克隆及分析显示日本看麦娘ACCase基因存在2个拷贝(Acc1;1和Acc1;2),并且均能够转录。对不同抗性种群进行ACCase CT区的基因克隆,并将其序列与敏感日本看麦娘进行比对分析发现这些种群中存在ACCase氨基酸的抗性突变:AHFD-1、AHFD-2种群发生了W2027C(色氨酸-2027-半胱氨酸)突变,该突变由密码子TGG突变为TGC导致;AHFD-3种群发生了D2078G(天冬氨酸-2078-甘氨酸)突变,该突变由密码子GAT突变为GGT导致;JCJT-1、JCJT-2、JCJT-3种群发生了I1781L(异亮氨酸-1781-亮氨酸)突变,该突变由密码子ATA突变为CTA或者TTA导致;JZJR-1种群发生了I2041N(异亮氨酸-2041-天冬酰胺)突变,该突变由密码子ATT突变为AAT导致;JLGY-4种群发生了W1999C和W1999L突变,W1999C突变由密码子TGG突变为TGC导致,W1999L突变由密码子TGG突变为TTG导致。ACCase氨基酸W1999C和W1999L突变首次在日本看麦娘中发现。以抗性JLGY-4种群和与其具有相似遗传背景的敏感JLGY-1种群日本看麦娘单株为研究对象,利用针对W1999C和W1999L突变建立的dCAPS分子检测方法作为分子标记明确每株供试杂草的基因型,并与其对6种ACCase抑制剂类除草剂的表现型进行系统的比较分析,揭示了W1999C突变不仅导致日本看麦娘对精噁唑禾草灵产生抗性,还导致对唑啉草酯产生较低水平的交互抗性,而不导致日本看麦娘对炔草酯、高效氟吡甲禾灵、烯草酮、烯禾啶产生交互抗性;W1999L突变仅导致日本看麦娘对精噁唑禾草灵产生抗性,不导致对炔草酯、高效氟吡甲禾灵、烯草酮、烯禾啶产生交互抗性。为消除遗传背景差异对抗性机理研究的影响,本研究通过对抗性种群JLGY-4的选育获得了具有W1999C突变的纯合日本看麦娘生物型及野生型(无抗性突变)日本看麦娘生物型。对ACCase的活性研究发现:突变型日本看麦娘ACCase对精噁唑禾草灵不敏感,精噁唑禾草灵抑制其酶活性50%的药剂浓度(IC50)为4.58μM,而野生型日本看麦娘的IC50为0.46μM,相对抗性倍数达9.96。这表明ACCase对精噁唑禾草灵敏感性的改变是W1999C突变型日本看麦娘对精噁唑禾草灵产生抗药性的重要靶标酶机理之一。为准确研究ACCase基因表达量的差异是否是W1999C突变型日本看麦娘对精噁唑禾草灵产生抗药性的机理,本研究先选择了8个常用的内参基因,利用内参基因筛选软件geNorm、NormFinder和BestKeeper进行了备选内参基因在日本看麦娘根、茎和叶组织中及药剂处理前后表达稳定性的筛选。从而确定EF1和UBQ做为内参基因研究ACCase基因在根组织中的表达量;确定18S、EF1、TUB和CAP做为内参基因研究ACCase基因在茎组织中的表达量;确定18S、GAPDH和EF1做为内参基因研究ACCase基因在叶组织中的表达量。利用筛选的内参基因进行了W1999C突变型和野生型日本看麦娘在精噁唑禾草灵处理前后,根、茎和叶中ACCase基因表达量的研究。结果表明突变型日本看麦娘相对于野生型日本看麦娘在根中ACCase基因的表达量在药剂处理前后均没有显著性差异,而在药剂处理2 h的叶中,药剂处理3d、5 d和7 d的茎中,突变型日本看麦娘ACCase基因的表达量显著高于野生型日本看麦娘。ACCase基因表达量的差异可能是W1999C突变型日本看麦娘对精噁唑禾草灵产生抗药性的靶标酶机理之一。本研究针对发现的抗性突变建立了dCAPS分子检测方法,该方法能够对I1781L、W1999C、W1999L、W2027C、I2014N、D2078G突变进行快速、准确的检测。利用所建立的dCAPS检测方法,对抗精噁唑禾草灵日本看麦娘AHFD-1、AHFD-2、AHFD-3、JZJT-1、JCJT-2、JCJT-3、JZJR-1、JLGY-4种群中的抗性突变进行了检测,发现AHFD-1、AHFD-2种群中杂合W2027C突变植株所占比例分别为86.46%和45.83%;AHFD-3种群中杂合D2078G突变植株所占比例为85.42%;JCJT-1、JCJT-2、JCJT-3种群中杂合I1781L突变植株所占比例都较高;JZJR-1种群中纯合I2041N突变植物所占比例为91.30%;JLGY-4种群中W1999C突变植株和W1999L突变植株所占比例分别为54.17%和4.17%。综上所述,本研究发现我国江苏、安徽小麦田日本看麦娘对精噁唑禾草灵的抗药性发生已经较为广泛,程度较为严重。抗性水平最高的种群已经对APP和PPZ类除草剂产生了抗性,而未对CHD和其它类除草剂产生抗药性。日本看麦娘为四倍体植物且ACCase基因存在两个拷贝。靶标酶氨基酸的突变是抗精噁唑禾草灵日本看麦娘种群较为普遍的抗性机理之一。ACCase氨基酸W1999C和W1999L突变,ACCase对精噁唑禾草灵敏感性的改变是日本看麦娘JLGY-4种群对精噁唑禾草灵产生抗性的重要靶标酶机理;而ACCase基因表达量的差异也可能是其抗性机理之一。针对日本看麦娘所有已知靶标酶抗性突变建立的dCAPS分子检测方法能够对由靶标酶突变引起的抗性进行快速、准确的检测。