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目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确损肝因素所致的以弥漫性肝细胞脂肪变性为主要特征的临床病理综合症,包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌。非酒精性脂肪性肝纤维化是该病进展为肝硬化的重要阶段,但其发病机制尚未明确,亦缺乏特效疗法。我们前期研究发现,扶正化瘀方可抑制肝脏氧化应激反应、调节炎症及纤维化相关基因的表达,阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的进展。近年研究发现,肝星状细胞活化与肝微循环障碍及新生血管增长有关,但血管生成相关基因在非酒精性脂肪性肝纤维化发生发展中的作用尚不清楚。本研究应用高脂、蛋氨酸-胆碱缺乏(methionine and choline deficient,MCD)饮食建立小鼠非酒精性脂肪性肝纤维化模型,扶正化瘀方及血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)激动剂血晶素(Hemin)进行干预,观察α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)及其下游血管生成相关基因血管内皮生成因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、诱导型一氧化氮合酶(inducible NO synthase,i NOs)和巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)m RNA和蛋白的表达变化,探明血管生成相关基因在非酒精性脂肪性肝纤维化进展中的作用及扶正化瘀方和/HO-1激动剂阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的主要机制,为临床治疗非酒精性脂肪性肝纤维化提供理论依据。方法:选用清洁级7~8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠30只,随机分为5组,每组6只,分别为对照组、模型组、扶正化瘀方组、血晶素组、扶正化瘀联合血晶素组。采用MCD饮食建立非酒精性脂肪性肝纤维化模型,分别应用扶正化瘀方、血晶素、扶正化瘀方联合血晶素进行干预,以胆碱-蛋氨酸充足饲料设立对照组。观察实验小鼠精神及活动情况、毛发及体重变化;8周末处死动物,留取部分肝组织,4%甲醛溶液固定,石蜡包埋,备做病理切片,其5μm切片,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察肝脏脂肪变、炎症程度、Masson三色染色观察肝组织纤维化程度;余肝组织以液氮速冻后置于-80oC冰箱保存,分别提取蛋白和RNA,采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction,Real Time PCR)检测α-SMA、HIF-1α、VEGF、i NOs和MIP-1αm RNA的表达情况;Western blot和免疫组织化学染色法检测α-SMA、HIF-1α、VEGF、i NOs和MIP-1α蛋白的表达情况,应用Quantity one分析系统软件对Western blot结果进行半定量分析,结果以HIF-1α/β-actin、VEGF/β-actin、i NOs/β-actin积分光密度比值表示。肝组织m RNA及蛋白表达数据以均数±标准差(x±s)表示,统计学分析采用SPSS16.0统计软件,各组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用Student-Newman-Keuls检验,P<0.05为差异有统计学意义。并对比分析上述基因表达与肝组织病理学变化的关系,明确不同基因表达水平与肝纤维化进展的关系。结果:1实验动物一般情况:对照组小鼠活泼,好动;毛发有光泽,体重随造模时间逐渐增加;模型组精神萎靡,少动,毛发无光泽,体重明显减轻;应用扶正化瘀方及血晶素组小鼠精神稍差,活动较少,毛发光泽较差,体重减轻,但较模型组明显好转,尤以扶正化瘀方联合血晶素组小鼠较模型组改善明显。2肝组织病理学变化:对照组小鼠肝小叶结构均正常,肝索排列整齐,以中央静脉呈放射状分布;模型组小鼠肝小叶结构紊乱,肝细胞呈现大泡性为主脂肪变性,小叶内可见点、灶状肝细胞坏死及炎细胞浸润、窦周纤维化,汇管区纤维组织增生,纤维间隔形成(NAS评分为5~6,肝纤维化评分为2~3);应用扶正化瘀方或血晶素组肝细胞脂肪变、炎症及纤维化较模型组明显改善(NAS评分为2~4,肝纤维化评分为1~2);血晶素联合扶正化瘀方组肝损伤进一步减轻(NAS评分为1~3,肝纤维化评分为0~1)。3肝组织α-SMA、HIF-1α、VEGF、i NOs和MIP-1αm RNA表达:模型组小鼠肝组织α-SMA、HIF-1α、VEGF、i NOs和MIP-1αm RNA表达较对照组均显著上调,依次为8.33±2.32 vs 1.01±0.19,4.50±0.78 vs 1.03±0.28,7.40±1.54 vs 0.92±0.20,9.94±1.60 vs 0.93±0.20,7.65±1.87 vs 1.01±0.11,P<0.001;与模型组相比,应用扶正化瘀方组肝组织α-SMA、HIF-1α、VEGF、i NOs和MIP-1αm RNA表达明显降低,依次为3.83±0.53,3.02±0.55,3.23±0.94,3.60±0.96,3.70±1.14,P<0.01;应用血晶素组上述基因m RNA表达亦较模型组明显降低,依次为3.94±0.83,2.29±0.78,3.17±1.06,2.81±0.41,4.16±1.31,P<0.001;扶正化瘀方联合血晶素组上述基因m RNA表达进一步下降,依次为2.33±0.76,1.61±0.20,1.58±0.23,2.09±0.62,2.07±0.10。4肝组织α-SMA、HIF-1α、VEGF、i NOs和MIP-1α蛋白表达:模型组小鼠肝组织α-SMA阳性面积百分比较对照组显著增加,为(1.08±0.20)%vs(0.29±0.07)%,P<0.001;与模型组相比,应用扶正化瘀方或血晶素组肝组织α-SMA阳性面积百分比明显下降,分别为(0.53±0.04)%、(0.49±0.11)%,P<0.001;扶正化瘀方联合血晶素组α-SMA阳性面积百分比进一步下降为(0.29±0.07)%;模型组小鼠肝组织HIF-1α、VEGF、i NOs蛋白表达较对照组均显著增强,依次为0.55±0.08 vs 0.24±0.07,1.08±0.034 vs 0.36±0.05,3.30±0.88 vs 1.08±0.09,P<0.001;应用扶正化瘀方组肝组织HIF-1α、VEGF和i NOs蛋白表达明显降低,依次为0.44±0.02,0.54±0.07,1.61±0.21,P<0.05;应用血晶素组上述基因蛋白表达水平亦较模型组明显降低,依次为0.36±0.11,0.46±0.05,2.31±0.39,P<0.01;扶正化瘀方联合血晶素组上述基因蛋白表达水平进一步下降,依次为0.28±0.02,0.31±0.06,1.26±0.38;模型组小鼠肝组织MIP-1α阳性面积百分比较对照组显著增加,为(0.71±0.09)%vs(0.11±0.03)%,P<0.001;与模型组相比,应用扶正化瘀方或血晶素组肝组织MIP-1α阳性面积百分比明显降低,分别为(0.41±0.07)%、(0.43±0.11)%,P<0.001;扶正化瘀方联合血晶素组上述基因蛋白阳性面积百分比为(0.25±0.07)%,较单用扶正化瘀方及血晶素组进一步降低。结论:1α-SMA、HIF-1α、VEGF、i NOs及MIP-1α在MCD饮食诱导的非酒精性脂肪性肝纤维化发生发展中具有重要作用。2扶正化瘀方通过抑制肝星状细胞活化,下调HIF-1α及其下游VEGF、i NOs等血管生成相关基因表达阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的发生进展。3扶正化瘀方与HO-1激动剂联合应用可协同抑制肝星状细胞活化及血管生成相关基因的表达,更有效地阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的进展。