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恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病。免疫治疗已成为第四大治疗手段，在恶性肿瘤治疗中发挥重要作用。肿瘤免疫治疗的关键，在于设法提高肿瘤的免疫原性，激发全身的抗肿瘤免疫应答、特别是特异性免疫应答，从而达到杀灭肿瘤的目的，而肿瘤疫苗的设计和治疗策略则符合以上原则。MAGE是一个恶性黑色素瘤基因家族，其成员在多种恶性肿瘤中均有表达，而在除睾丸和胎盘外的正常组织中均不表达。MAGE基因编码的抗原肽可与人类白细胞抗原分子结合形成复合物并被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的T细胞受体(TCR)所识别，诱导特异性CTL的杀伤活力。因此，MAGE抗原被认为是肿瘤特异性免疫治疗的理想免疫原，可以作为肿瘤治疗型疫苗的靶抗原。核酸疫苗作为第三代疫苗较前两代疫苗具有更多优势，尤其是RNA疫苗。而树突状细胞(DC)作为人体内功能最强大的专职抗原递呈细胞，是天然的免疫佐剂，已有研究证明以DC为免疫佐剂的肿瘤疫苗具有更强大的抗肿瘤特异性免疫杀伤作用。本研究首先从mRNA水平检测MAGE-1、-2、-3基因在胃癌组织中的表达，并分析其与胃癌临床生物学特点的相关性；构建MAGE-3稳定表达质粒，体外转录获得其mRNA产物，再以MAGE-3mRNA转染DC构建以DC为免疫佐剂的MAGE-3mRNA肿瘤疫苗，并对其抗肿瘤天津医科大学博士学位论丈免疫功效进行体外评价，为将mRN八勺C肿瘤疫苗应用于肿瘤临床治疗打下基础。检索国内外文献，未见以MAGE一3作为靶抗原构建mRN内心C肿瘤疫苗的报道。第一部分M[A GE基因在胃癌中的表达及与肿瘤临床特点的相关性研究 一、胃癌及癌旁正常组织中MAGE一1、一2、。3基因表达检测 应用RT.PCR法在mRNA水平对62例胃癌组织及癌旁正常组织中MAGE一1、一2、一3基因的表达进行检测。结果显示，胃癌组织中MAGE，1、一、一3基因表达阳性率分别为11.29%(刃62)、24.19%(15/62)和38.71%(24/62)，50.0%的胃癌组织表达MAGE-1、一2、一3中的至少一种，而所有癌旁正常组织均不表达MAGE基因。胃癌组织中MAGE一3基因表达阳性率与MAGE.1和MAGE一2相比存在统计学差异(p<0.05)。 二、分析胃癌组织中MAGE.1、.2、一3基因表达与临床特点的相关性 统计学分析显示，胃癌组织中MAGE一1、一2、一3基因表达与患者年龄、性别、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移之间不存在相关性(p>0.05)。 由此得出结论，MAGE一3基因在胃癌组织中有较高表达，其表达与胃癌患者的年龄、性别、临床及病理学分期等因素无关。肿瘤特异性抗原MAGE.3抗原是肿瘤特异性免疫治疗的理想免疫原，可以作为肿瘤治疗型疫苗的靶抗原。第二部分MAGE一mR饰叼DC肿瘤疫苗的构建 天津医科大学博士学位论文 应用限制性内切酶Mlul和sall对载体pMAGE一3 ORFIT和标准质粒pa分别进行酶切后，得到MAGE召ORF和pCI线性化质粒并产生粘末端，在T4连接酶作用下将二者连接生成重组子，经筛选和测序获得pCI.MAGE一3稳定表达载体，转化细菌、质粒提取、酶切纯化后获得MAGE-3 cDNA转录模板，在竹RNA聚合酶作用下体外转录产生加帽的、带有poly(A)尾的MAGE一3 mRNA。采用同样方法同时构建pCI一EG即稳定表达载体并获得EGFP mRNA，作为对照及免疫评价中的无关抗原。 采集、分离肿瘤患者外周单核细胞富集血，贴壁培养后分离出单核细胞和淋巴细胞。单核细胞加入IL4和GM一CSF诱导培养为未成熟DC备作转染用，淋巴细胞加入IL.2维持生长备作免疫评价中的效应细胞。形态学和表型检测结果证明，体外诱导培养后的DC具有树突状细胞典型的形态和表面标志，以这种方法培养的Dc可以用作肿瘤疫苗的构建. 将MAGE一3 mRNA用阳离子脂质体DMRIE一C包裹后转染DC，构建出MAGE一3 mRNA旧C肿瘤疫苗。RT.PCR检测结果证明转染后的DC中有MAGE-3 mRNA存在;同样方法以EGFP mRNA转染后的DC在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，证明转染后的DC可以表达目的抗原。结合上述2个结果，证明MAGE一3 mRNA瓜C肿瘤疫苗构建成功。第三部分MAGE一mRN旬勺C肿瘤疫苗免疫保护效应的体外评价 一、用ELISA法检测DC转染前后I卜12分泌水平，可见转染后DC分泌112的量高于未经转染的DC和PBMC，MAGE一3 mRNA瓜C组与DC组(p<0.05)和PBMc组(p<0.05)相比均存在显著差异。由于112可诱导免疫反应朝Thl方向发展，此结果说明此疫苗有刺激肿瘤免疫的能力。 二、以直接免疫荧光法检测 MAGE．3 mRNMIC刺激前后淋巴细胞亚群的变化，发现CDS十和代表NK细胞的CD56十所占比例上升，证明MAOE3mRNA oC可诱导自体 T淋巴细胞向 Cy方向分化增殖。 三、EMSA法检测 MAGE．3 mRNA／DC致敏的 CDS＋ffil再次接受相同抗原刺激时分泌IFN．Y的能力，显示其分泌水平明显高于以无关抗原或DC刺激后的分泌量，证明 mRNA oC疫苗的效应细胞主要是抗原特异性 Ch。 四、细胞毒性T细胞活性检测（细胞毒试验）结果显示，MAGE－3mRNMIC诱导的CIL在3个效靶比对同种抗原靶细胞均有较强的杀伤作用，对无关抗原 EGpp mRNA oC和脂质