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粘细菌是一类具有复杂多细胞社会学行为的革兰氏阴性杆状细菌。它以群体运动、子实体发育及捕食等复杂的多细胞群体行为及产生多种生物活性物质而著称。目前对几种粘细菌研究发现,此种菌体胞内可以积累主要成分为三酰基甘油酯(TAG)的内含物。M. xanthus DK1622中关于TAG内含物的研究报道,指出TAG内含物在细胞发育分化过程中起到关键作用。本实验室发现纤维堆囊菌So0157-2胞内也可积累9种脂肪酸(碳原子数目有13-18个)形成的TAG内含物,经研究表明TAG内含物可以作为碳源和能源的贮存对于菌体的生长及次级代谢有着重要的作用。但目前对于粘细菌TAG的代谢酶研究却鲜有报道。其基础生理代谢特性的研究,对粘细菌资源开发与利用具有巨大的理论意义和经济价值。纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)具备合成大量抗真菌、抗细菌和抗肿瘤作用生物活性分子的能力。其合成种类多样,结构新颖的次级代谢产物,被认为是寻找药源化合物的良好目标。另外,S. cellulosum对大量大分子如多聚糖及脂类也具有极好的降解能力,但是这些降解途径涉及的酶类却很少被研究。S.cellulosum目前被认为已知最大的细菌基因组,其中So ce56菌基因组达13.1Mb。信息学分析发现,So ce56菌基因组内预测到32个可编码lipase/eaterase的ORF。而这些ORF的编码产物与研究报道的lipase/eaterase同源性极低,说明该基因组编码的酶尚未被研究开发。这些性质预示着S. cellulosum该类酶可能具有潜在的特殊性质及实际应用价值。本论文的工作基于S. cellulosum So ce56、So0157-2及M. xanthus DK1622基因组测序的基础上,对三种菌株内TAG的代谢途径中涉及的关键合成酶二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)及降解酶(脂肪酶)基因进行了分析,以了解粘细菌中TAG代谢酶的特点,挖掘相应的酶基因资源。由于S. cellulosum So0157-2遗传操作体系不成熟,随后选择S. cellulosum So0157-2中的TAG降解酶(脂肪酶)基因lipA、 lipB,进行大肠杆菌基因克隆、异源表达、获得重组活性蛋白并进行酶学性质的检测,以探索粘细菌脂肪酶的生理生化特性及潜在工业应用价值。同时通过同源重组原理对粘细菌DK1622中TAG代谢途径涉及的合成及降解酶基因进行敲除,获得敲除株并进行生理特征的分析,以便对其菌体内基因的生理功能进行探索。首先,本文对S. cellulosum So ce56、SoO157-2及M. xanthus DK1622基因组进行分析,得到了三种菌株内TAG的代谢途径中涉及的关键合成酶(DGAT)及降解酶(脂肪酶)基因的候选基因。了解到粘细菌基因组中TAG代谢相关酶基因比较丰富,但是本研究涉及的TAG关键合成及降解酶基因与已研究论证过的序列同源性较低,具有一定新颖性。因而本实验具有较高的创新性,为后续基因表达及功能的研究提供基础。选择S. cellulosum So0157-2中的TAG降解酶(脂肪酶)基因lipA,进行了基因克隆和表达,将表达后的活性蛋白进行纯化,并研究其酶学性质。生物信息学分析发现其与已研究过的脂肪酶基因同源性低于30%,预示着该酶基因可能具有一定新颖性及特殊性质。针对lipA序列设计引物,成功构建表达载体pET22b-LipA,通过诱导条件的优化获得可溶表达,并通过亲和层析获得了电泳纯重组蛋白r-LipA。酶学性质分析发现,r-LipA最适反应温度为30℃,在0℃仍然保持了35.2%的相对活性,当温度达到60℃时检测不到酶活。55℃处理30min后,r-LipA仅残留80%的酶活,半衰期仅为10min。因此,根据适冷酶的定义,r-LipA为一个典型的适冷脂肪酶。R-LipA的最适反应pH值为8.0,在pH3.0-10.5之间均可以保持较高活性,表明该酶具有一定碱耐受性。R-LipA的底物特异性实验结果显示该酶对中短链的脂类具有较好降解作用,这与So0157-2内积累的TAG碳链长度具有较大差异,显示LipA可能不是参与TAG降解途径的关键酶。多种金属离子均对酶活起到促进作用,尤其Mg2+(10mM)和PCa2+(10mM)可以使r-LipA的活性提高到1.26倍及1.4倍。去垢剂实验表明r-LipA对大多数商业应用去垢剂均有明显耐受作用,同时该酶对各种有机溶剂显示极好的耐受性。R-lipA作为一个适冷的脂肪酶,具有特殊的去垢剂及有机溶剂耐受性,可以应用到一些需要低温的有机合成、非水相合成及一些食品产业生产过程中。Blastp分析LipB与已研究报道的lipase序列具有较高相似性。蛋白跨膜区域预测显示该蛋白序列具有三个明显的疏水区域,这也是导致后续异源表达难以实现可溶表达及蛋白复性酶活较低的主要原因。经过更换表达载体及诱导条件的尝试,随后选用pCold-TF载体获得了蛋白的可溶表达,但是目标蛋白纯化后酶活基本丧失,无法进行后续实验。最终选择pET28a-LipB载体进行目的蛋白的表达与纯化。由于包涵体纯化复性后酶活较低,使用较灵敏的GENMED细菌脂肪酶活性比色法定量检测试剂盒进行r-LipB酶学性质的分析。结果显示r-LipB最适温度为30℃,同r-LipA结果相似,这与S.cellulosumSo0157-2的最适生长温度也一致。说明脂肪酶基因lipA.lipB极有可能是So0157-2生长所必需基因。该部分实验为后续实验的正确开展奠定良好的基础。最后,为了探索TAG代谢酶基因的菌体内生理功能,我们选择在具有成熟遗传操作体系及菌株性状检测方法的DK1622内展开相关实验。通过同源重组原理对M.xanthus DK1622中TAG代谢途径涉及的合成及降解酶基因进行敲除,所有的突变株内含物合成能力依然存在,生长、运动及EPS形成能力基本不受影响。但是在子实体发育与生孢能力分析中发现,基因缺失突变株YL1801及YL1803子实体发育与生孢能力增强。另外根据子实体的热处理实验结果推测MXAN4638、MXAN5522及MXAN6874基因与组成细胞膜的脂类合成可能具有一定关系。具体影响机理还需进一步实验论证。同时在So0157-2中利用实验室前期建立的抗生素添加的接合转移体系为基础,对已得到的目的基因-TAG合成关键酶(二酰基甘油酰基转移酶,DGAT)及降解酶(脂肪酶,TAGL)的编码基因：dgat,lipA,lipB进行敲除,以期望获得这些酶缺失的突变株。进而从内含物水平与埃博霉素产量上考察三酰基甘油合成途径的阻断对菌体碳源积累与次级代谢的影响。目前,我们成功构建了dgat及lipB的基因敲除的接合转移诱动载体。三酰基甘油酯酶的一次同源重组的接合子也已经获得。但是由于纤维堆囊菌遗传操作体系不成熟,相关后续实验还需要进一步优化进行。期望后续的实验能够获得完全的基因敲除突变株,在内含物积累消耗与埃博霉素产量上考察三酰基甘油合成与降解的阻断对菌体碳源积累与次级代谢的影响,同时获得较高底物利用效率的埃博霉素产生菌株。